人臍帶間充質干細胞促進B細胞增殖和終末分化.pdf

1、課題一:人臍帶間充質干細胞促進B細胞增殖和終末分化
　　 背景:間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一類具有自我更新(self renewal)和多向分化潛能(multi-lineage differentiation)的成體干細胞。它來源廣泛，可從骨髓、脂肪、臍帶、臍血、胎盤等多種組織中分離得到，并且不同來源的MSCs都具有相似的免疫調節(jié)、造血支持和組織修復功能。目前MSCs對T淋巴細胞的免

2、疫抑制作用成為MSCs對于自身免疫性疾病臨床治療應用的理論基礎，但是MSCs對B淋巴細胞的免疫調節(jié)仍需要進一步的深入探討。
　　 目的:探討人臍帶來源間充質干細胞對B淋巴細胞的增殖和終末分化的免疫調節(jié)并揭示其主要的作用機制。
　　 方法:(1)應用流式細胞技術檢測臍帶來源間充質干細胞免疫表型以及胚胎干細胞的全能標志物。(2)間充質干細胞三系分化誘導培養(yǎng):定向誘導人臍帶來源的間充質干細胞向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化，

3、用油紅O染色、Von Kossa染色、番紅O染色觀測脂滴形成、鈣鹽沉積和膠原合成情況以鑒定人臍帶來源的間充質干細胞的多向分化潛能。(3)體外建立人臍帶來源的間充質干細胞和CD19+B淋巴細胞的共培養(yǎng)體系利用Brdu酶聯免疫吸附法(Brdu ELISA試驗)檢測B淋巴細胞的增殖情況，并且用流式細胞檢測技術檢測B淋巴細胞的終末分化標志CD138的表達情況;利用酶聯免疫吸附試劑盒檢測B淋巴細胞IgM、IgA、IgG的分泌水平，從而反映人臍帶來

4、源的間充質干細胞對活化后的B淋巴細胞的增殖和終末分化影響。(4)用transwe(ll)24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)人臍帶來源的間充質干細胞和CD19+T淋巴細胞以研究人臍帶來源的間充質干細胞發(fā)揮免疫抑制作用是否需要細胞直接接觸。(5)利用酶聯免疫吸附試劑盒檢測共培養(yǎng)體系中PGE2和IL-6的分泌水平，并在共培養(yǎng)體系中加入PGE2合成酶的抑制劑吲哚美辛以及IL-6中和抗體，檢測其增殖和IgM、IgA、IgG分泌情況以驗證其主要的介導因子。(6)將6

5、-8周BALB/c分為8組，分別標記A-H，其中A和D注射T細胞依賴性抗原Ⅰ(TNP-Ficoll)、B和E組注射T細胞依賴性抗原Ⅱ(TNP-KLH)、C和F組注射T細胞非依賴型抗原(TNP-LPS)，小鼠骨髓間充質干細胞培養(yǎng)至3代，A、C、E、G組注射1*106/支小鼠骨髓MSC，B、D、F組注射PBS，H組為陰性對照組。7天后收集血清并檢測其IgM的分泌水平，14天后再次收集血清并檢測其IgG的分泌水平。對比小鼠骨髓MSC對體內免疫

6、球蛋白分泌的影響。
　　 結果:(1)人臍帶MSCs表達CD13、CD29、CD49e、CD44、CD90、CD105、CD166和HLA-ABC(HLA-Ⅰ);均不表達造血細胞相關標志CD3、CD11b、CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD133和HLA-DR(HLA-Ⅱ)等;(2)人臍帶來源的MSCs具有向脂肪細胞、骨細胞和成軟骨三系分化的能力。(3)人臍帶MSCs促進B細胞的增殖。(4

7、)人臍帶MSCs促進B細胞的終末分化和免疫球蛋白分泌。(5)人臍帶MSCs對B細胞的作用是通過可溶性因子實現的，其中PGE2發(fā)揮重要的作用，但是IL-6未有明顯的作用。(6)人臍帶MSCs促進體內T細胞依賴性抗體和非依賴型抗體的產生。
　　 結論:人臍帶來源MSCs促進B細胞的增殖和終末分化作用，并且MSCs是通過分泌可溶性細胞因子PGE2而非IL-6發(fā)揮著促進作用的。
　　 課題二:人臍帶來源間充質干細胞免疫活性檢測<

8、br>　　 背景:間充質干細胞作為一種成體干細胞，其最初對MSCs的研究主要關注于其向多種組織細胞類型分化的可塑性和再生能力，但是目前更多的關注集中到MSCs免疫調節(jié)功能，且目前研究比較清楚的是對外周血單個核細胞尤其是TH1型細胞因子分泌的免疫抑制作用。雖然目前的間充質干細胞的免疫調節(jié)機制并不非常清楚，但是越來越多的研究表明間充質干細胞是通過可溶性細胞因子來實現的。故間充質干細胞是目前治療一些免疫性疾病尤其是自身免疫性疾病的理想細胞，

9、但是由于不同組織來源甚至不同個體來源的間充質干細胞其免疫學活性并不完全相同，目前缺乏對間充質干細胞免疫學活性檢測的定量方法，而使的間充質干細胞的臨床應用過于凌亂，缺乏統一性的標準。
　　 目的:探討尋找定量檢測臍帶間充質干細胞免疫學活性的定量的方法，為臨床的量化應用打下基礎。
　　 方法:(1))體外檢測人臍帶來源的間充質干細胞和健康成人外周血單個核細胞的共培養(yǎng)體系，利用酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測其IFN-(γ)的分泌水

10、平，而反映人臍帶來源的間充質干細胞對活化后的外周血單個核細胞免疫抑制作用。將2×105hUC-MSCs接種于6孔板，2h貼壁后換液，加或不加IL-1β培養(yǎng)一段時間后，收集上清。采用酶聯免疫吸附法對間充質干細胞PGE2的分泌進行定量檢測。(2)建立不同濃度外源性PGE2和活化的健康成人外周血單個核細胞的培養(yǎng)體系，采用酶聯免疫吸附法檢測不同濃度外源性PGE2對外周血單個核細胞IFN-(γ)分泌進行檢測，確定外源性PGE2對外周血單個核細胞I

11、FN-(γ)分泌的抑制曲線。(3)將收集的上述臍帶間充質干細胞培養(yǎng)上清50μL加入150μL成人外周血單個核細胞培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)3天后收集上清， ELISA檢測IFN-(γ)的分泌。
　　 結果:(1)人臍帶來源的間充質干細胞能夠抑制活化的外周血單個核細胞IFN-(γ)的分泌，并且主要是通過分泌PGE2來實現的。(2)臍帶間充質干細胞在24小時時PGE2的分泌量最大，以后隨時間的延長而逐漸下降。不同個體來源的臍帶間充質干細胞分泌

12、PGE2差別很大。(2)外源性PGE2以劑量依賴性抑制外周血單個核細胞IFN-(γ)的分泌，在1ng/mL-50ng/mL的濃度范圍內變化最為明顯。(3)人臍帶來源間充質干細胞上清中PGE2在與外源性PGE2相同的濃度范圍內能夠模擬外源性PGE2對外周血單個核細胞IFN-(γ)分泌的抑制作用，并且不同個體來源的臍帶間充質干細胞對IFN-(γ)分泌的抑制能力不同。
　　 結論:不同個體來源臍帶間充質干細胞的免疫調節(jié)能力不同，我們將

13、5×105臍帶間充質干細胞在6孔板、2mL的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)24小時后其上清中能否分泌20ng/mL的PGE2量定為臍帶間充質干細胞免疫強弱的臨界點，≥20ng/mL其免疫能力強，＜20ng/mL其免疫能力弱。
　　 課題三:IL-1β對人臍帶來源間充質干細胞造血支持的促進作用
　　 背景:骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）作為骨髓造血微環(huán)境中重要的組成

14、細胞是眾多造血微環(huán)境細胞的前體細胞，其對造血干細胞的增殖分化起重要的支持作用。但是，成人骨髓間充質干細胞存在來源有限、取樣時要進行侵襲性操作以及間充質干細胞的絕對數量和增殖分化能力會隨著供者年齡增加而下降等不足而限制了其廣泛應用。研究表明其他來源間充質干細胞同樣具有造血支持作用，臍帶間充質干細胞來源廣泛、無倫理學限制、更強的增殖能力、長期培養(yǎng)和傳代后仍然維持干細胞特性而成為細胞治療中一種非常有希望的替代性干細胞，但是其造血支持能力仍有限

15、，因此尋找加強間充質干細胞造血支持的方法成為MSC用于造血支持細胞治療的必要。
　　 目的:本研究旨在探討IL-1β對人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)的及造血支持的影響。
　　 方法:將分離得到的hUC-MSCs(human umbilical cord mesenchymal stem cells)以2×106接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，貼壁2小時后，加入10ng/mL IL-1β(interleukin1β)培養(yǎng)

16、36小時后收集培養(yǎng)上清和細胞。觀察有/無IL-1β的條件培養(yǎng)基對CD34+細胞粒系集落形成單位(Colony-Forming Unit-Granulocyte，CFU-G)、巨噬系集落形成單位(Colony-Forming Unit-Macrophage CFU-M)和粒-巨噬集落形成單位(Colony-Forming Unit-Granulocyte Macrophage，CFU-GM)、紅系爆式集落形成單位(Burst Formin

17、g Unit-Erythroid，BFU-E)、紅系集落形成單位（Colony-FormingUnit-Erythroid CFU-E）和粒紅單巨核集落形成單位(Colony-Forming Unit-Granulocyte/Erythroid/Macrophage/Monocyte CFU-GEMM)的集落形成能力的影響;實時定量PCR(real time PCR)檢測加/不加IL-1β hUC-MSCs的造血相關因子G-CSF、GM

18、-CSF、M-CSF、IL-6、SOD2、CDK6、TRIM22 mRAN的變化;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測造血相關因子GM-CSF、M-CSF、IL-6蛋白濃度的差異。
　　 結果:①含有IL-1β的hUC-MSCs條件培養(yǎng)基能明顯增強CD34+細胞集落形成能力，且以粒系和粒-單核集落形成單位為主;②IL-1β促進hUC-MSCs GM-CSF、G-CSF、IL-6的mRNA的表達;③IL-1β促進hUC-MSCs G