脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化及血管發(fā)生.pdf

1、目的:探索大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化及形成血管的潛能,并將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)復(fù)合在生物材料絲素上埋植到SD大鼠體內(nèi),探討絲素材料及細(xì)胞復(fù)合型絲素在體內(nèi)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成及血管形成的可行性。
　　 方法:
　　 1.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)、鑒定:取SD大鼠附睪旁脂肪組織,剪碎,用0.15％膠原酶Ⅰ型37℃消化45分鐘,等量含15％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化,2800轉(zhuǎn)離心

2、16分鐘,取細(xì)胞沉淀種板中,在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MTT法測定、繪制第3代ADSCs細(xì)胞生長曲線；激光共聚焦顯微鏡觀察ADSCs在絲素上的生長情況。用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)作為ADSCs的誘導(dǎo)因子,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長、變化情況及Matrigel上成血管的形態(tài)學(xué)變化,流式細(xì)胞儀鑒定ADSCs與誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá),透射電鏡觀察所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　 2.絲

3、素材料與Matrigel凝膠復(fù)合ADSCs及所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)成血管實(shí)驗(yàn):選取200g～300g8周至12周齡SD雄性大鼠40只,隨機(jī)分為五組:A1空白絲素對照組(n=8)；A2BrdU標(biāo)記的ADSCs+多孔絲素材料組(n=8)；A3BrdU標(biāo)記的ADSCs誘導(dǎo)成的內(nèi)皮細(xì)胞+多孔絲素材料組(n=8)；B1空白Matrigel立體培養(yǎng)基組(n=8)；B2BrdU標(biāo)記的開始誘導(dǎo)的ADSCs+Matrigel立體培養(yǎng)基組(n=8)。麻醉后

4、常規(guī)消毒鋪巾,于大鼠背側(cè)左右兩側(cè)各做兩處皮下切口,長約1cm,按各分組情況分別埋入移植物,間斷縫合切口。術(shù)后分批處死動(dòng)物,收集標(biāo)本,行HE染色組織學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)觀察BrdU和FⅧ-Ag陽性細(xì)胞分布。
　　 主要結(jié)果:
　　 1.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)、鑒定:原代ADSCs培養(yǎng)2h細(xì)胞開始貼壁,5～7d細(xì)胞長滿板底,用0.25％胰酶-0.02％EDTA液消化后,進(jìn)行傳代培養(yǎng),第3代ADSCs細(xì)

5、胞形態(tài)呈均一長梭形。第3代ADSCs用MTT法測定、繪制的生長曲線呈緩慢生長期、對數(shù)生長期、而后進(jìn)入平臺期的表現(xiàn)。激光共聚焦顯微鏡下看到細(xì)胞在被掃射的每層絲素材料面上生長良好,細(xì)胞增殖多。倒置顯微鏡下觀察到ADSCs用內(nèi)皮誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14d后,呈鋪路石樣結(jié)構(gòu)。Matrigel復(fù)合ADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo),24小時(shí)細(xì)胞遷徙成團(tuán)有小足伸出,7d成網(wǎng)格狀,13d后形成較長血管,22～30d見較長血管的厚度在增加且有分枝出現(xiàn)。流式細(xì)胞儀鑒定,第三

6、代ADSCs呈CD44陽性、CD31陰性表達(dá)；ADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)14d后,細(xì)胞呈現(xiàn)CD44陰性、CD31陽性表達(dá),透射電鏡下看到內(nèi)皮細(xì)胞特有的W-P小體。
　　 2.1組織學(xué)觀察
　　 A1組術(shù)后1w絲素材料中少量血管、纖維組織生長,少量淋巴細(xì)胞浸潤,絲素結(jié)構(gòu)完整。隨著時(shí)間延長,絲素中血管生長增多,術(shù)后4w見較多血管、纖維組織沿絲素材料孔隙生長,少量淋巴細(xì)胞浸潤,絲素結(jié)構(gòu)完整。
　　 A2組術(shù)后1w絲素材料

7、中少量血管、纖維組織生長,少量淋巴細(xì)胞浸潤,絲素結(jié)構(gòu)完整。術(shù)后4w大量血管、纖維沿絲素材料孔隙生長,且可見到較多管徑較大的血管。少量淋巴細(xì)胞浸潤。絲素材料有少量降解。
　　 A3組術(shù)后1w絲素材料中有較多血管、纖維組織生長,少量淋巴細(xì)胞浸潤,絲素結(jié)構(gòu)完整。術(shù)后4w可見豐富的血管、纖維沿絲素材料孔隙生長,不僅有較多管徑較大的血管,且存在豐富的毛細(xì)血管。淋巴細(xì)胞浸潤較前減少。絲素材料有少量降解。
　　 A1、A2、A3組都可

8、觀察到隨時(shí)間延長,絲素材料與周圍組織交界區(qū)域血管數(shù)量逐漸增加。
　　 B1組術(shù)后1w少量血管生長,未見纖維組織,很少淋巴細(xì)胞浸潤。Matrigel凝膠與周圍組織無明顯界限。術(shù)后4w大量血管生長,很少淋巴細(xì)胞浸潤。不能觀察到Matrigel凝膠。
　　 B2組術(shù)后1w較多血管生長,未見纖維組織,很少淋巴細(xì)胞浸潤。Matrigel凝膠與周圍組織無明顯界限。術(shù)后4w有豐富的血管生長,且可見到較多管徑較大血管。很少淋巴細(xì)胞浸潤。

9、不能觀察到Matrigel凝膠。
　　 2.2BrdU、FⅧ-Ag陽性細(xì)胞分布情況
　　 術(shù)后1w、2w、3w、4w在A2、A3、B2組中均可見到不同密度的BrdU陽性細(xì)胞。隨時(shí)間延長,BrdU陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增加。
　　 術(shù)后1w、2w、3w、4w在A1、A2、A3、B1、B2組中均可見到FⅧ-Ag陽性細(xì)胞,術(shù)后4wFⅧ-Ag陽性細(xì)胞在A1、A2、A3、B1、B2中的陽性細(xì)胞數(shù)分別為(25.08±8.35/HP)

10、、(30.05±7.59/HP)、(36.12±12.58/HP)、(25.24±9.41/HP)、(32.09±13.14/HP),A2、A3組陽性細(xì)胞數(shù)較A1組明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。A3較A2組陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。B2較B1組陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。A3與B2組陽性細(xì)胞數(shù)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 主要結(jié)論: