sox4單克隆抗體的制備

1、生物工程學(xué)報ChinJBiotech2009February2525(2):257262journals.im.ChineseJournalofBiotechnologyISSN10003061cjb@im.?2009InstituteofMicrobiologyCASAccepted:December32008Supptedby:NationalHighTechnologyResearchDevelopmentProgram(863P

2、rogram)(No.2006AA02A245)NationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30771981)NaturalScienceFoundationofBeijing(No.7082070).Crespondingauth:NingGuo.Tel:861068213039Email:.國家高技術(shù)研究與發(fā)展項目(863計劃)(No.2006AA02A245)國家自然科學(xué)基金項目(No.3

3、0771981)北京市自然科學(xué)基金項目(No.7082070)資助。醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)SOX4單克隆抗體的制備及其在腫瘤細(xì)胞表達(dá)分析中的應(yīng)用于鳴1穆蕊2呂明1李愛玲2郭寧11軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞免疫學(xué)研究室北京1008502國家生物醫(yī)學(xué)分析中心北京100850摘要:應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了含SOX4編碼序列的原核表達(dá)載體在大腸桿菌DH5?中獲得了GSTSOX4融合蛋白的可溶性表達(dá)。應(yīng)用谷胱甘肽Sepharose4B對重組蛋白

4、進(jìn)行了純化利用純化的融合蛋白免疫小鼠制備了可特異性識別SOX4的單克隆抗體。通過間接ELISA法鑒定了抗體的效價為110?5Westernblotting分析證實了抗體的特異性。結(jié)果顯示該抗體可識別細(xì)胞內(nèi)外源性過表達(dá)及內(nèi)源性的SOX4蛋白。在培養(yǎng)細(xì)胞系、小鼠不同組織中SOX4蛋白的表達(dá)存在顯著的差異。本研究制備的SOX4單克隆抗體具有良好的特異性為進(jìn)一步研究SOX4在腫瘤發(fā)生中的作用提供了重要的工具。關(guān)鍵詞:SOX4融合蛋白單克隆抗體腫

5、瘤發(fā)生PreparationofthemonoclonalantibodyagainstSOX4proteindetectionofSOX4expressionlevelindifferenttumcelllinesMingYu1RuiMu2MingL1AilingLi2NingGuo11DepartmentofMolecularImmunologyInstituteofBasicMedicalSciencesAcademyofMili

6、taryMedicalSciencesBeijing100850China2NationalCenterofBiomedicalAnalysisBeijing100850ChinaAbstract:InthepresentstudyweconstructedaprokaryoticexpressionvectcontainingSOX4proteinencodingsequences.TheGSTSOX4solubleproteinwa

7、sexpressedinEscherichiacoliDH5?purifiedbyglutathionesepharose4B.ThepurifiedrecombinantproteinwasusedtoimmunizeBalbCmicethemonoclonalantibodyagainstSOX4waspreparedbyusinghybridomatechnique.Thetiteroftheantibodywasdetermin

8、edas110?5byindirectELISA.ThespecificityoftheantibodywasverifiedbyWesternblottinganalysis.ThemonoclonalantibodyspecificallyrecognizedtheoverexpressedexogenousSOX4proteinaswellasendogenousSOX4protein.TheexpressionlevelofSO

9、X4proteinindifferentcelllinesmousetissueswasdetectedbyusingtheantibody.DifferentialexpressionoftheproteinwasdemonstratedbyWesternblotting.Thedataindicatedthattheantibodywasspecific.Theantibodycanbeusedasanimptanttoolffur

10、therexplationoftheroleofSOX4intumigenesis.2ISSN10003061CN111998QChinJBiotechFebruary252009Vol.25No.2Journals.im.PAGE分離細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜Westernblotting分析抗體對SOX4蛋白的識別。一抗分別采用抗Myc單克隆抗體及SOX4單克隆抗體二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgGECL顯色。1.8SOX4蛋

11、白在不同腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)分析檢測的細(xì)胞包括：肝癌細(xì)胞HepG2、乳腺癌細(xì)胞ZR751、MDA231和MCF7、肺癌細(xì)胞H460、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、骨肉瘤細(xì)胞U2OS、人胚腎細(xì)胞HEK293及293T細(xì)胞。通過Westernblotting分析檢測SOX4蛋白在不同細(xì)胞系中的表達(dá)。1.9SOX4蛋白在不同小鼠組織和人腫瘤組織中的表達(dá)分析分別取4~6周齡BALBc小鼠的生殖腺、胸腺、腦等組織制備組織勻漿通過Westernblotti

12、ng分析檢測SOX4蛋白在小鼠不同組織中的表達(dá)。同時采集3對人肺癌及癌旁組織樣品通過Westernblotting分析檢測人癌旁及腫瘤組織中SOX4蛋白的表達(dá)。2結(jié)果2.1pGEXKGGSTSOX4(130~344aa)原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定將構(gòu)建的pGEXKGGSTSOX4(130~344aa)原核表達(dá)載體用BamHI和HindIII雙酶切經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析可見酶切反應(yīng)產(chǎn)物中出現(xiàn)大小約為640bp的片段表明目的片段已成功地插入表達(dá)

13、載體(圖1)。經(jīng)核酸序列測定證實插入片段為SOX4編碼序列且序列完全正確。用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)超聲裂解全菌后通過SDSPAGE鑒定在約49kD處可見預(yù)期分子量大小的條帶證實GSTSOX4(130~344aa)融合蛋白在轉(zhuǎn)化菌中表達(dá)成功而用IPTG誘導(dǎo)pGEXKGGST空載體轉(zhuǎn)化菌則未見此條帶(圖2)。進(jìn)一步通過對轉(zhuǎn)化菌超聲后的上清及沉淀進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物存在于轉(zhuǎn)化菌超聲上清中表明重組蛋白以可溶性形

14、式表達(dá)。2.2重組蛋白的純化在小量誘導(dǎo)表達(dá)的基礎(chǔ)上將pGEXKGGSTSOX4(130~344aa)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的DH5??接種于400mL培養(yǎng)基IPTG誘導(dǎo)后收集轉(zhuǎn)化菌超聲上清用谷胱甘肽Sepharose4B珠子純化GSTSOX4(130~344aa)融合蛋白SDSPAGE分析結(jié)果見圖3。通過洗脫、凍干后獲得了純化的GSTSOX4(130~344aa)重組蛋白。圖1質(zhì)粒pGEXKGSOX4(130~344aa)的酶切鑒定Fig.1Id

15、entificationoftherecombinantvect.pGEXKGSOX4(130?344aa)byrestrictionenzymedigestion.1:befedigestion2:afterdigestionM:marker.圖2融合蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2Expressionofthefusionproteinatasmallscalebyinduction.1:befeinductionfpGEXKG2:af