人凝血因子Ⅶ單克隆抗體的制備與應(yīng)用初探.pdf

1、目的：探索從血漿蛋白生產(chǎn)Cohn氏法組分Ⅲ(組分Ⅲ)純化人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的方法；制備能穩(wěn)定分泌人FⅦ單克隆抗體的雜交瘤細胞株；純化人FⅦ單克隆抗體以及初探其應(yīng)用。 方法：(1)將組分Ⅲ溶解，經(jīng)檸檬酸鋇吸附、洗脫、硫酸銨沉淀、兩次DEAE-SepharoseFastFlow離子交換層析和SephadexG-100凝膠過濾純化人FⅦ。(2)以純化的人FⅦ為抗原免疫BALB/c小鼠，用免疫后小鼠的脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞進行

2、融合，間接ELISA方法篩選出能分泌人FⅦ單克隆抗體的鼠-鼠雜交瘤細胞；并用雜交瘤細胞體內(nèi)誘生法從小鼠的腹腔制備腹水，經(jīng)過硫酸銨沉淀、DEAE-affi-gel-blue凝膠層析純化單克隆抗體；鑒定抗體的亞類、抗體與凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ(FⅡ、FⅨ、FⅩ)的交叉反應(yīng)性、二價金屬離子對抗原抗體結(jié)合的影響等特性。(3)把人FⅦ單克隆抗體連接到GoldMag-@金磁微粒表面，檢測連接效率和連接后的抗體與血漿和濃縮FⅦ的反應(yīng)，用含有二價金屬離子的

3、緩沖液進行洗脫，探索用單克隆抗體制備缺乏FⅦ血漿、純化FⅦ的方法和可行性。 結(jié)果：(1)從400g組分Ⅲ中最終提取到10.1mgFⅦ，活性為1775.8U/mg，F(xiàn)Ⅶ被濃縮了近6000倍，最終的回收率為17.6％，SDS-PAGE電泳鑒定只有1條主條帶。(2)成功制備出22株分泌人FⅦ單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為HFⅦ001～022，從其中選取6株制備腹水，并對抗體進行純化。6株抗體重鏈的亞類均為IgG1；抗體均和FⅡ、FⅨ

4、、FⅩ沒有交叉反應(yīng)；其中有2株抗體與FⅦ的結(jié)合明顯受Zn2+的抑制；有1株抗體可以抑制血漿FⅦ的凝血活性。(3)抗體與金磁微粒結(jié)合效率很高；結(jié)合后的抗體，有1株可以把血漿中的部分FⅦ分離出來；有3株與金磁微粒結(jié)合的抗體可以結(jié)合濃縮的FⅦ，結(jié)合的FⅦ在有Zn2+存在時能解離下來，可以用于純化FⅦ。 結(jié)論：建立起從組分Ⅲ中純化人FⅦ的方法；制備出能分泌人FⅦ單克隆抗體的雜交瘤細胞株并純化出單克隆抗體。用FⅦ單克隆抗體純化人FⅦ是可行