豬脾樹突狀細胞對豬細小病毒樣顆粒的體外內吞研究.pdf

1、豬細小病毒樣顆粒(Recombinant Parvovirus-like Particles，PPV-VLPs)保留了天然病毒的空間構象和誘導中和抗體的抗原表位，且能夠將外源型豬瘟病毒E290基因片段插入形成嵌合型豬細小病毒樣顆粒(PPV-VLPs-E290)，但PPV-VLPs-E290作為外源性抗原，被提呈進入MHCⅠ類分子途徑，并激活CTL反應的機制目前尚不明確。為了探明該機制，本研究在已經成功構建了豬細小病毒樣顆粒(PPV-VL

2、Ps-E290)的基礎上，將動物體內抗原提呈功能最強、也是唯一能激活初始T淋巴細胞的樹突狀細胞(DC)作為抗原提呈細胞，對PPV-VLPs-E290在DC細胞中的定位、捕獲以及提呈情況進行了研究。
　　為了探明豬細小病毒樣顆粒(PPV-VLPs-E290)在樹突狀細胞(DC)中的定位情況，本研究首先通過磁性篩選的方法從豬的脾臟分離CD172a+ CD11R+ DC，將PPV-VLPs-E290用熒光素FITC標記后，體外與DC在3

3、7℃下作用，應用流式細胞儀檢測在體外DC對PPV-VLPs的捕獲情況。結果顯示，F(xiàn)ITC陽性細胞的比例為72％左右，表明DC在體外能有效捕獲PPV-VLPs-E290。捕獲PPV-VLPs-E290的DC用皂苷透化后，分別與內吞體的表面標志分子Rab5、Rab7、Rab11、Lamp2單克隆抗體及PE標記的PPV-VP2抗體反應，通過共聚焦顯微鏡檢測PPV-VLPs-E290在DC中的定位情況。結果顯示，PPV-VLPs可與晚期內吞體相

4、關蛋白分子Lamp2及Rab7的單抗共定位，而與Rab5、Rab11不共定位，表明PPV-VLPs被DC捕獲后，定位于DC的晚期內吞體。
　　為了探明豬脾樹突狀細胞(DC)捕獲豬細小病毒樣顆粒的方式，DC首先經低滲和鉀離子缺乏處理先與抑制DC細胞不同提呈途徑的藥物如氯丙嗪、二甲基氨基吡咪、松胞素D、菲律平等分別在37℃下作用1h后，再與熒光素FITC標記的豬細小病毒樣顆粒(FITC-PPV-VLPs-E290)在37℃下作用4h，

5、應用流式細胞儀及共聚焦顯微鏡檢測在體外DC對PPV-VLPs的捕獲情況。結果顯示，鉀離子缺乏及氯丙嗪對DC的捕獲效率無影響，而經二甲基氨基吡咪、菲律平及松胞素D處理的DC對PPV-VLPs-E290捕獲效率明顯下降。表明DC對PPV-VLPs-E290的捕獲與肌動蛋白、巨胞飲及小窩蛋白介導的方式有關，而與網格蛋白介導的方式無關。
　　為了進一步對DC捕獲FITC-PPV-VLPs-E290的方式進行鑒定，本研究又將DC與DC捕獲抗

6、原各個不同途徑中的關鍵因素抗體如:肌動蛋白抗體，小窩蛋白caveolin-1抗體、豬IgG受體FcγRI(CD64)的抗體及DEC205抗體分別在37℃下作用1h后，再與FITC-PPV-VLPs-E290在37℃下作用1h，應用流式細胞儀及共聚焦顯微鏡檢測體外DC對FITC-PPV-VLPs-E290的捕獲情況。結果顯示，經肌動蛋白抗體處理的DC幾乎不能捕獲FITC-PPV-VLPs-E290，經caveolin-1的抗體處理的DC對

7、PPV-VLPs-E29的捕獲效率明顯下降。而CD64及DEC205抗體則對DC的捕獲效率無影響，進一步表明DC對PPV-VLPs-E290的捕獲依賴于肌動蛋白，與巨胞飲、小窩蛋白介導的內吞方式有關，而與吞噬作用及DEC205依賴的網格蛋白介導的方式無關。
　　為了檢測PPV-VLPs-E290在DC中被DC攝取后的提呈情況。本研究通過磁性篩選的方法從豬瘟疫苗免疫豬的脾臟分離CD4-CD8+T細胞。DC先分別與伯氨喹、放線菌酮、氯

8、喹、乳胞素、布雷菲德菌素A及亮抑肽酶、胃酶抑素作用，再與PPV-VLPs-E290在37℃作用4h，然后與CD4-CD8+T細胞共孵育，制備效應細胞，利用細胞毒性殺傷實驗檢測PPV-VLPs-E290在DC中的提呈情況。結果顯示，放線菌酮、氯喹、乳胞素、布雷菲德菌素A(BFA)可強烈抑制DC對PPV-VLPs-E290提呈，胃酶抑素部分抑制，而經伯氨喹、亮抑肽酶處理的DC對PPV-VLPs-E290的提呈則不受影響。這些結果表明，DC對