豬β-防御素2多克隆和單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、抗菌肽是由動(dòng)物機(jī)體自身分泌的抵抗外界病原微生物的一類微量的重要蛋白質(zhì),它在動(dòng)物的先天免疫中發(fā)揮十分重要的作用。因其獨(dú)特的抗菌機(jī)制、廣泛的抗菌譜以及不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),近年來(lái)成為研究的熱門。防御素是其中一類重要的小分子陽(yáng)離子抗菌肽。目前有不少研究者試圖通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大量表達(dá)防御素,以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的抗病能力。為了建立檢測(cè)豬β-防御素2(PBD2)在豬和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá),本研究制備了PBD2的多克隆抗體和單克隆抗體,建立了間接免疫熒光和

2、免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法。
　　 本研究根據(jù)PBD2的氨基酸序列,人工合成了PBD2的11肽,與鑰匙孔血藍(lán)蛋白KLH偶聯(lián)成全抗原PBD2-KLH,免疫Balb/C小鼠,三次免疫后,以合成的37肽作為PBD2抗體的檢測(cè)抗原,檢測(cè)小鼠血清效價(jià),均達(dá)到1:12800以上,取其血清制備小鼠抗PBD2的多克隆抗體,并利用該鼠源PBD2多抗建立了PBD2的間接免疫熒光檢測(cè)方法。
　　 通過(guò)間接ELISA方法篩選出抗體水平高的小鼠,取其脾

3、細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,用間接ELISA方法篩選出陽(yáng)性克隆,用有限稀釋法進(jìn)行兩次亞克隆,最后獲得5株雜交瘤細(xì)胞株1C2、1F4、2H2、3A2和481,均能夠穩(wěn)定分泌特異性好、效價(jià)高的PBD2單克隆抗體,其細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體ELISA效價(jià)達(dá)到1:210以上,腹水的抗體的ELISA效價(jià)達(dá)到l:106以上。
　　 分別取臨床健康豬和胸膜肺炎放線桿菌血清1型4074株感染豬的肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、小腸等組織,用制備的單克隆