NS3蛋白對(duì)乙型腦炎病毒增殖的影響及其宿主互作蛋白的篩選.pdf

1、流行性乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(JEV)引起的一種主要經(jīng)蚊蟲傳播的人畜共患傳染病，對(duì)人類健康與養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生極大危害。JEV感染宿主細(xì)胞具有一個(gè)完整的復(fù)制周期，包括吸附、穿入、脫殼、合成、組裝與釋放。JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3是一個(gè)具有多種酶活性的蛋白，其在JEV感染與復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。乙腦病毒作為一個(gè)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的病毒，宿主與病毒蛋白之間的相互作用被認(rèn)為是乙腦病毒致病的重要機(jī)制。本研究運(yùn)用RNAi技術(shù)研究JEV NS3基因的沉默對(duì)體內(nèi)和

2、體外JEV增殖的影響，并利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)篩選能與NS3蛋白互作的宿主細(xì)胞蛋白，旨在深入地了解NS3蛋白對(duì)JEV增殖的影響及其具體作用機(jī)制。本研究不僅為闡明乙腦病毒增殖機(jī)理提供重要理論依據(jù)，還為抗病毒藥物靶點(diǎn)的研究開辟新的方向。
　　1、NS3蛋白對(duì)乙型腦炎病毒增殖影響的研究
　　設(shè)計(jì)了4個(gè)乙型腦炎病毒NS3基因的RNAi靶位點(diǎn)，分別位于JEV基因組4656-4676、4827-4847、4916-4936與53

3、61-5381位，將其插入表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo中，構(gòu)建了能夠?qū)hRNA導(dǎo)入細(xì)胞的重組表達(dá)質(zhì)粒pGP-shRNA，并證明了shRNA質(zhì)粒能夠特異性抑制NS3基因的表達(dá)。將shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BHK21細(xì)胞后，間隔24h感染JEV。JEV感染細(xì)胞72h后，收集病毒培養(yǎng)物，運(yùn)用熒光定量PCR，空斑減少實(shí)驗(yàn)，間接免疫熒光與Western blot檢測(cè)JEV增殖量的變化。結(jié)果顯示4個(gè)shRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)JEV的增殖均有不同程度的

4、抑制作用。其中pGP-NS3-4質(zhì)粒（基因組5361-5381）抑制效果最為顯著，其使細(xì)胞中JEV mRNA的含量降低93.9％;病毒滴度下降大約950倍;間接免疫熒光結(jié)果顯示細(xì)胞中乙腦病毒數(shù)量明顯減少，Western blot結(jié)果顯示乙腦病毒結(jié)構(gòu)蛋白E蛋白含量顯著降低。
　　將7日齡乳鼠分為7組，每組6只，4個(gè)pGP-shRNA質(zhì)粒分別每只腦內(nèi)接種2μg，接種24h后以10×LD50的劑量進(jìn)行腦內(nèi)攻毒，攻毒5d后，取鼠腦制成10

5、％組織懸液，應(yīng)用空斑減少實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度。結(jié)果顯示4個(gè)shRNA質(zhì)粒均使乳鼠腦組織中JEV的病毒滴度顯著降低，其中pGP-NS3-4質(zhì)粒（基因組5361-5381）效果最佳，使毒價(jià)下降大約2400倍。又將pGP-NS3-4質(zhì)粒接種3周齡小鼠，間隔24h以不同劑量攻毒，結(jié)果顯示pGP-NS3-4質(zhì)粒能為3周齡小鼠提供一定保護(hù)，10×LD50攻毒組保護(hù)率高達(dá)70％，50×LD50攻毒組保護(hù)率為60％。
　　本研究證明了NS3蛋白對(duì)JE

6、V的增殖具有重要作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了JEV基因組5361-5381位是一個(gè)高效的NS3基因沉默靶位點(diǎn)，針對(duì)該位點(diǎn)的基因沉默對(duì)JEV在體內(nèi)外增殖具有顯著的抑制作用。該研究為乙腦病毒NS3蛋白功能以及其作為抗乙腦病毒靶點(diǎn)的深入研究提供了重要支持。
　　2、乙型腦炎病毒NS3蛋白宿主細(xì)胞互作蛋白篩選
　　以JEV野毒分離株SCYA201201為模板，擴(kuò)增全長(zhǎng)NS3基因，并將其插入pGBKT7載體構(gòu)建了pGBKT7-NS3誘餌質(zhì)粒。隨后

7、將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母菌Y2HGold，獲得了誘餌酵母菌，并對(duì)誘餌酵母菌進(jìn)行了包括毒性、自激活驗(yàn)證和蛋白表達(dá)鑒定，結(jié)果顯示NS3片段的插入對(duì)誘餌酵母菌沒有毒性作用，NS3基因沒有自激活作用并且誘餌酵母菌能成功表達(dá)全長(zhǎng)NS3蛋白。
　　采用Gold Yeast Two-Hybrid System系統(tǒng)將構(gòu)建的誘餌酵母菌與人腦組織cDNA文庫(kù)酵母菌進(jìn)行酵母雙雜交，連續(xù)在DDO/X/A和QDO/X/A營(yíng)養(yǎng)缺失平板上篩選，經(jīng)過三輪的篩選，最終

8、獲得了21個(gè)陽性克隆子。陽性克隆子經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，利用文庫(kù)質(zhì)粒的抗性篩選出單克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示除了8個(gè)重復(fù)序列、4個(gè)非編碼區(qū)序列和1個(gè)移碼突變序列外，最終獲得了8個(gè)NS3宿主互作蛋白的編碼基因序列，將這些序列在NCBI上進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示它們與Genbank中的參考序列相似性均高達(dá)99％以上。隨后將這8個(gè)文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌Y187株，構(gòu)建獵物酵母菌，并將之與NS3誘

9、餌酵母菌進(jìn)行回復(fù)雜交驗(yàn)證，同時(shí)設(shè)立文庫(kù)菌自激活對(duì)照組，結(jié)果顯示8個(gè)雜交菌落均呈現(xiàn)陽性，自激活對(duì)照組全為陰性，回復(fù)驗(yàn)證成功。
　　本研究成功從人腦組織cDNA文庫(kù)中篩選獲得8個(gè)新的宿主互作蛋白，其分別是:腓骨蛋白FBLN5、蛋白磷酸脂酶PPP2CB、CRBN蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體GPR137B、泛素結(jié)合酶UBE2N、鋅指蛋白ZNF350、熱激蛋白Hsp40和信號(hào)復(fù)合體蛋白COP9。這些互作蛋白的成功篩選為深入研究NS3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及N

10、S3蛋白參與JEV增殖的機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。
　　3、乙型腦炎病毒NS3蛋白與宿主細(xì)胞蛋白相互作用的驗(yàn)證
　　本研究運(yùn)用了免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證宿主互作蛋白與乙腦病毒NS3蛋白的相互作用。首先提取人腎上皮細(xì)胞（293細(xì)胞）的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板分別擴(kuò)增出了8個(gè)互作蛋白的編碼基因，并插入真核表達(dá)載體pCMV-HA構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒。同時(shí)將乙腦NS3基因插入另一真核表達(dá)載體pEGFP構(gòu)建了pEGFP-NS3

11、真核表達(dá)質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示乙腦病毒NS3蛋白與6個(gè)宿主互作蛋白可以成功表達(dá)。
　　將NS3真核表達(dá)質(zhì)粒與互作蛋白表達(dá)質(zhì)粒一對(duì)一組合，共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24h，非變性裂解細(xì)胞，收集蛋白。運(yùn)用免疫磁珠法沉淀蛋白互作復(fù)合物，收集共沉淀產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE與Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示宿主細(xì)胞中的熱激蛋白Hsp40(DNAJB6)可與乙腦病毒NS3蛋白