利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選PEDV蛋白間互作及與nsp14、nsp16互作的宿主蛋白.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，主要特征表現(xiàn)為急性腸炎、嘔吐、腹瀉和脫水，各年齡階段的豬均易感，初生仔豬最為嚴重，發(fā)病率和死亡率極高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。酵母雙雜交系統(tǒng)是目前研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種有效技術(shù)，該系統(tǒng)靈敏性高，能檢測到生物體內(nèi)很弱的蛋白質(zhì)相互作用。本研究主要利用酵母雙雜交系統(tǒng)探究PEDV各病毒蛋白間存在的相互作用以及分別篩選與PEDV nsp14、ns

2、p16存在相互作用的宿主蛋白。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.酵母雙雜交實驗分析PEDV各蛋白間的相互作用
　　首先，構(gòu)建PEDV除nsp11外所有病毒蛋白的兩套酵母融合表達質(zhì)粒，包括誘餌蛋白質(zhì)粒pGBKT7-X(bait)和獵物蛋白質(zhì)粒pGADT7-X(prey)共44個，對其進行自激活活性和毒性檢測，發(fā)現(xiàn)pGBKT7-nsp15、pGADT7-nsp4、pGADT7-nsp5、pGADT7-nsp15對酵母Y2H菌株有一定毒

3、性，pGBKT7-nsp3-1有自激活活性（不能用于酵母雙雜交實驗）。然后，將所有bait和prey質(zhì)粒以點對點的方式兩兩共轉(zhuǎn)化酵母Y2H菌株以檢測PEDV各蛋白間存在的相互作用，通過酵母雙雜交實驗共篩選了462組互作，結(jié)果篩選到46組存在相互作用，包括29組單向互作，12組雙向互作及5組自身互作。
　　2.豬小腸上皮細胞酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及鑒定
　　首先在體外培養(yǎng)豬小腸上皮細胞并提取其總RNA，以總RNA為模板合

4、成含有與pGADT7-Rec線性載體同源末端的ds-cDNA，然后將ds-cDNA與pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)入酵母Y187菌株中，通過同源重組獲得酵母雙雜交cDNA文庫，最后將所有克隆收集并分裝成1ml文庫用于雙雜交篩選。本實驗成功構(gòu)建并鑒定了一個較高質(zhì)量的豬小腸上皮細胞酵母雙雜交cDNA文庫，文庫滴度6.5×108 cfu/mL，文庫容量1.04×1011cfu。
　　3.篩選cDNA文庫以獲得與PEDV nsp14、nsp16

5、相互作用的宿主蛋白
　　將誘餌蛋白質(zhì)粒pGBKT7-nsp14和pGBKT7-nsp16分別轉(zhuǎn)化Y2H菌株，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別與1mL豬小腸上皮細胞酵母雙雜交cDNA文庫共培養(yǎng)，通過對文庫的篩選分析得到nsp14和nsp16的潛在互作宿主蛋白。通過酵母回復雜交實驗發(fā)現(xiàn)nsp14與宿主蛋白CCT7、EIF3I存在相互作用，nsp16與宿主蛋白DDIT4、UBE2K、UBA52存在相互作用。通過免疫共沉淀實驗進一步發(fā)現(xiàn)，在HEK293T細胞