AE-,3-介導(dǎo)的油茶皂苷抗心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷及其機制的研究.pdf

1、目前，我國冠心病、急性心肌梗塞等缺血性心臟病的發(fā)病率與死亡率明顯上升，嚴(yán)重危害人們健康。溶栓、介入、冠脈搭橋等再灌注療法是治療冠心病、急性心肌梗塞等缺血性心臟病最主要的措施，但這些治療措施在帶來有益治療效果的同時，卻會引起潛在的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。因此，如何減輕甚至解除心肌I/R損傷受到廣大基礎(chǔ)和臨床研究者的高度關(guān)注。針對心肌I/R損傷的保護(hù)，人們進(jìn)行了積極的研究與探討，從對心肌I/R損

2、傷機制的研究，到心肌缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用的探索，發(fā)展到藥理性預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)，已取得了許多令人鼓舞的成果，但距臨床應(yīng)用仍有一定的距離。我國中藥資源極為豐富，如何從中發(fā)掘出更加安全有效的防治心肌I/R損傷的藥物，特別是對其活性成分進(jìn)行藥效學(xué)及作用機制的研究是當(dāng)前我國醫(yī)藥界所面臨的一大課題。 為此，本研究擬從細(xì)胞水平，通過心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygenation，A/R)損傷模型模擬在體I/R損傷，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和基

3、因轉(zhuǎn)染及RNA干擾等分子生物學(xué)手段以期闡明SQS預(yù)處理所產(chǎn)生的抗心肌細(xì)胞A/R損傷作用與AE3蛋白表達(dá)的關(guān)系，明確AE3蛋白介導(dǎo)SQS抗心肌細(xì)胞A/R損傷的分子機制，并進(jìn)一步明確SQS預(yù)處理上調(diào)AE3表達(dá)的信號通路，從而為進(jìn)一步開發(fā)SQS提供理論和實驗依據(jù)。 第一部分油茶皂苷預(yù)處理對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷及AE3蛋白表達(dá)的影響 目的： 在觀察SQS對原代心肌細(xì)胞A/R損傷保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察SQS對A/R

4、損傷所誘發(fā)的氧化應(yīng)激、Ca2+超載、細(xì)胞凋亡等影響；同時觀察SQS對A/R損傷心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度以及AE3基因表達(dá)的影響，初步探討AE3蛋白與SQS抗心肌細(xì)胞A/R損傷的相關(guān)性。 方法： 1.利用原代分離培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞，隨機分為5組：①正常對照(Control)組，②缺氧/復(fù)氧組(A/R)，③0.1μM油茶皂苷預(yù)處理組(SQS—0.1)，④1μM油茶皂苷預(yù)處理組(SQS-1)，⑤10μM油茶皂苷預(yù)處理組(SQS

5、-10)。除對照組外，均建立缺氧/復(fù)氧損傷模型。 2.MTT法檢測各實驗組心肌細(xì)胞的存活率；按試劑盒說明測定各組心肌細(xì)胞內(nèi)LDH的活性、MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、GSH—Px的活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測各實驗組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS、游離鈣以及氯離子濃度的變化；Annexin V—FITC/PI雙染法檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率的改變。 3.RT—PCR半定量檢測各實驗組心肌細(xì)胞內(nèi)AE3 mRNA的表達(dá)變化；Western

6、 Blot檢測各組心肌細(xì)胞中AE3蛋白的表達(dá)。 4.統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS11.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和t檢驗以P<0.05作為判定統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)論： 1.在原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞水平上，再次證實SQS預(yù)處理對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；同時SQS劑量依賴性地抑制缺氧/復(fù)氧所誘發(fā)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、鈣超載及細(xì)胞凋亡。 2.SQS預(yù)處理可上調(diào)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞

7、AE3基因表達(dá)，同時抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)氯過載。 3.AE3可能參與SQS抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷。 第二部分 RNA干擾技術(shù)沉默AE3基因?qū)τ筒柙碥湛剐募〖?xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響 目的： 構(gòu)建靶向AE3的RNAi真核表達(dá)載體，建立AE3低表達(dá)的細(xì)胞系，觀察AE3低表達(dá)對SQS抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響，反向驗證AE3基因在這一過程中的重要作用及機制。 方法： 1.設(shè)計靶

8、向AE3基因的3條候選RNA干擾序列，利用真核表達(dá)載體pSilencerTM3.1-H1 hygro構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2心肌樣細(xì)胞；同時設(shè)計并構(gòu)建靶向GAPDH基因的陽性對照及陰性對照RNA干擾重組載體，用于鑒定pSilencerTM3.1-H1 hygro質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾體系的有效性。 2.瞬時轉(zhuǎn)染后，RT—PCR和Western Blot檢測AE3基因mRNA和蛋白表達(dá)，篩選最有效的RNA干擾靶片段；轉(zhuǎn)染攜帶綠色熒光

9、蛋白的pEGFP—Cl質(zhì)粒，熒光顯微鏡監(jiān)測瞬時轉(zhuǎn)染不同時相的轉(zhuǎn)染效率；將篩選出的抑制AE3表達(dá)最有效的重組載體用于穩(wěn)定篩選低表達(dá)AE3基因的H9c2細(xì)胞，同時篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSilencer—NC陰性對照載體的細(xì)胞作為對照；最后通過RT—PCR及Western Blot測定穩(wěn)定篩選出的細(xì)胞中AE3基因mRNA和蛋白的表達(dá)。 3.SQS分別預(yù)處理未轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陰性對照細(xì)胞H9c2/pSilencer—NC和AE3低

10、表達(dá)的細(xì)胞系H9c2/pSilencer—siAE3，缺氧/復(fù)氧后，通過MTT法檢測細(xì)胞存活率；化學(xué)比色法測定細(xì)胞內(nèi)MDA含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、GSH—Px的活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS、游離鈣以及氯離子濃度；Annexin V—FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率；分析AE3基因沉默前后SQS對上述指標(biāo)影響的變化。 結(jié)論： 1.pSilencerTM3.1-H hygro質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾體系能夠有效抑

11、制H9c2心肌樣細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。 2.針對AE3 mRNA序列521～541 bp位置設(shè)計并構(gòu)建的RNA干擾重組載體pSilencer—AE3-A能夠最有效抑制靶基因的表達(dá)，抑制率達(dá)75％以上。 3.成功構(gòu)建的低表達(dá)AE3基因的H9c2/pSilencer—siAE3細(xì)胞，可用于AE3及相關(guān)基因功能分析的進(jìn)一步研究。 4.利用AE3低表達(dá)的細(xì)胞系H9c2/pSilencer—siAE3，反向證實AE3介導(dǎo)了S

12、QS對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，其機制可能通過抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)氯過載及減少細(xì)胞內(nèi)ROS含量，進(jìn)而抑制缺氧/復(fù)氧所致的氧化應(yīng)激、鈣超載及細(xì)胞凋亡，從而對缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。 第三部分油茶皂苷預(yù)處理上調(diào)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞AE3表達(dá)的信號機制 目的： 利用NO合成酶和ERK1/2抑制劑，從NO和ERK1/2途徑初步探討SQS上調(diào)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞AE3基因表達(dá)的信號機制

13、。 方法： 1.利用原代分離培養(yǎng)的薪生大鼠心肌細(xì)胞，隨機分為5組：①正常對照(Control)組，②缺氧/復(fù)氧組(A/R)，⑨10μM油茶皂苷預(yù)處理組(SQS-10)，④NO抑制劑L—NAME處理組(L—NAME)，⑤ERK1/2抑制劑PD98059處理組(PD98059)。除對照組外，均建立缺氧/復(fù)氧損傷模型。 2.MTT比色法檢測各實驗組心肌細(xì)胞的存活率；利用全自動生化分析儀測定各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活

14、性；硝酸還原酶法測定各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的濃度；Western Blot檢測ERK1/2蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)水平。 3.RT—PCR半定量檢測各實驗組心肌細(xì)胞內(nèi)AE3 mRNA的表達(dá)變化；Western Blot檢測各組心肌細(xì)胞中AE3蛋白的表達(dá)。 4.統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS11.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和t檢驗以P<0.05作為判定統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)論： SQS預(yù)處理上調(diào)缺氧/

15、復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)AE3的表達(dá)涉及NO和ERK1/2信號途徑。 論文意義： 1.本研究在心肌細(xì)胞水平上，進(jìn)一步驗證了SQS可劑量依賴性地對抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷；同時研究發(fā)現(xiàn)SQS可抑制心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷所誘發(fā)的氧化應(yīng)激、鈣超載和細(xì)胞凋亡。 2.本研究率先提出了SQS抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的新機制。即SQS可能通過ERK1/2信號途徑上調(diào)AE3基因表達(dá)從而降低缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)[Cl—]i及RO