缺氧-氧再灌注誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老的機(jī)制及其干預(yù)研究.pdf

1、衰老是細(xì)胞脫離細(xì)胞周期并不可逆地喪失增殖能力后進(jìn)入一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。自Hayflick等首次從人類(lèi)纖維原細(xì)胞發(fā)現(xiàn)衰老現(xiàn)象后，人們逐漸發(fā)現(xiàn)人類(lèi)其它各類(lèi)細(xì)胞和其它物種的纖維細(xì)胞也存在著衰老。細(xì)胞發(fā)生衰老以后主要表現(xiàn)在細(xì)胞周期的改變、13．半乳糖苷酶活性的變化、線(xiàn)立體的皺縮與衰老基因的表達(dá)增加等。細(xì)胞衰老可以促進(jìn)生物衰老，不僅與腫瘤發(fā)生有關(guān)，而且與心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、心律失常等心血管疾病發(fā)生有著密切的關(guān)系。因此，深入研究衰老的機(jī)制有著重

2、要意義。 缺氧-氧再灌注是細(xì)胞、組織與器官最常見(jiàn)的損傷因素，也是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老的常見(jiàn)方法。最近國(guó)外有研究顯示缺氧與氧再灌可以使骨髓造血細(xì)胞發(fā)生衰老。 他汀類(lèi)藥物通過(guò)抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶的活性而抑制膽固醇的合成，常用來(lái)治療高膽固醇血癥，他汀類(lèi)藥物還可降低冠心病患者的死亡率、提高心臟移植患者的生存率、改善心肌重構(gòu)等作用。除了調(diào)節(jié)膽固醇代謝外，最近Assmus等報(bào)道他汀類(lèi)藥物可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白，下調(diào)細(xì)胞周期抑

3、制因子p27K<'kipl>，抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的衰老。Pravastatin除了心血管保護(hù)作用給患者帶來(lái)的益處外，是否同時(shí)具有抑制缺氧/氧再灌注誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老，對(duì)心臟產(chǎn)生保護(hù)作用呢? 在本研究中，將了解缺氧/氧再灌注是否能誘導(dǎo)培養(yǎng)SD乳大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生衰老；研究缺氧/氧再灌注誘導(dǎo)培養(yǎng)SD乳大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生衰老的機(jī)制；并擬采用pravastatin對(duì)缺氧/氧再灌注誘導(dǎo)SD乳大鼠心肌細(xì)胞的衰老進(jìn)行干預(yù)，觀(guān)察細(xì)胞周期與β-半乳糖苷酶活

4、性等經(jīng)典的細(xì)胞衰老指標(biāo)的變化，以探討pravastatin是否對(duì)心肌細(xì)胞衰老有抑制作用及可能機(jī)制。 第一部分 SD乳大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定與缺氧/氧再灌注誘導(dǎo)建立SD乳大鼠心肌細(xì)胞衰老模型 目的：在成功分離、培養(yǎng)SD乳大鼠心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上，探討獲得較純心肌細(xì)胞的方法以及采用缺氧/氧再灌注誘導(dǎo)建立SD乳大鼠心肌細(xì)胞衰老模型的可行性。 方法：采用胰蛋白酶消化心肌組織分離單個(gè)心肌細(xì)胞，聯(lián)合差速貼壁與培養(yǎng)基中加入Brd

5、u殺死心肌成纖維細(xì)胞。心肌細(xì)胞在含1％O<.2>與99％N2的孵育箱中缺氧培養(yǎng)6 h，在21％02與5％CO<,2>孵育箱中進(jìn)行氧再灌注培養(yǎng)24和48 h，建立心肌細(xì)胞衰老模型。采用免疫組化檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞α-actin表達(dá)情況；透射電鏡觀(guān)察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變：BrdU摻入試驗(yàn)了解心肌細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；β-半乳糖苷酶試劑盒檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。 結(jié)果：經(jīng)α-actin抗體鑒定顯示分離培養(yǎng)的細(xì)胞中95％以上是心

6、肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞經(jīng)缺氧/氧再灌注誘導(dǎo)后，細(xì)胞體積變大、線(xiàn)立體明顯皺縮。 細(xì)胞增殖結(jié)果顯示缺氧/氧再灌注組心肌細(xì)胞Brdu陽(yáng)性率較對(duì)照組有顯著下降(P<0.01)；細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示缺氧/氧再灌注組心肌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞較對(duì)照組有顯著增多(P<0.01)，S期細(xì)胞較對(duì)照組有顯著減少(P<0.01)；α-半乳糖苷酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示氧再灌注組心肌細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性較對(duì)照組與缺氧6 h有顯著提高(P<0.01)。 結(jié)論：

7、 1．采用胰蛋白酶消化心肌組織分離心肌細(xì)胞，聯(lián)合差速貼壁與培養(yǎng)基中加入Brdu殺死心肌成纖維細(xì)胞，可以獲得較純的心肌細(xì)胞，經(jīng)α-actin抗體鑒定顯示分離培養(yǎng)的細(xì)胞中95％以上是心肌細(xì)胞。 2．我們首次采用缺氧／氧再灌注，成功誘導(dǎo)建立了SD乳大鼠心肌細(xì)胞衰老模型，為心肌細(xì)胞衰老機(jī)制的研究提供了穩(wěn)定可靠的模型。 第二部分 缺氧/氧再灌注誘導(dǎo) SD 乳大鼠心肌細(xì)胞衰老的機(jī)制研究 目的:從細(xì)胞周期調(diào)控方面探討缺

8、氧/氧再灌注誘導(dǎo) SD 乳大鼠心肌細(xì)胞衰老的分子機(jī)制 方法：采用teal-time quantitative PCR與western blot方法檢測(cè)培養(yǎng)SD乳大鼠心肌細(xì)胞在對(duì)照組、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h，心肌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(D1)，細(xì)胞周期依賴(lài)激酶(CDK4)，細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期依賴(lài)激酶復(fù)合物抑制劑(p21WAF1，p16IN4Ka)，Rb蛋白，p53等基因的mRNA與蛋白水平的表達(dá)變化。 結(jié)果：

9、 (1)Cyclin D1與β-actin基因mRNA水平的比值在缺氧6 h、氧再灌注24和48 h分別為O.024，O.082，0.092，與對(duì)照組0.005相比有顯著增高(P

10、基因mRNA水平比值在缺氧6 h、氧再灌注24和48 h，分別為O.008，0.005，O.005與對(duì)照組O.011相比有顯著降低(P

11、RNA水平比值在缺氧6 h、氧再灌注24和48 h，分別為0.009，O.009，0.012與對(duì)照組O.006相比有顯著增高(P

12、RNA水平比值在缺氧6 h、氧再灌注24和48 h，分別為O.002，0.003，0.004與對(duì)照組0.001相比有顯著增高(P

13、，O.003，與對(duì)照組O.002相比有顯著增高(P

14、照組0.001相比有顯著增高(P

15、對(duì)缺氧/氧再灌注誘導(dǎo)SD乳大鼠心肌細(xì)胞衰老的干預(yù)研究 目的:了解pravastatin對(duì)缺氧/氧再灌注誘導(dǎo)SD乳大鼠心肌細(xì)胞衰老是否有抑制作用及其機(jī)制。 方法：Pravastatin干預(yù)濃度為lO<'-7>-10<'-5>mol/1，方法參考第一部分方法。 結(jié)果：Pravastatin干預(yù)后對(duì)照組、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h的G0/G1期細(xì)胞分別為71.98％，86.47％，84.98％，88.78％較實(shí)

16、驗(yàn)組72.71％，87.45％，87.97％，89.78％沒(méi)有明顯減少(P>O.05)，同樣對(duì)照組、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h的S期細(xì)胞分別為20.34％，9.02％，6.06％，5.79％較實(shí)驗(yàn)組20.03％，9.01％，5.06％，4.93％沒(méi)有明顯增多(P>O.05). Pravastatin干預(yù)后，對(duì)照組、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h的半乳糖苷酶活性陽(yáng)性細(xì)胞分別為9.13％，12.55％，42.15％，53.48％