缺氧對(duì)大鼠心肌細(xì)胞損傷作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究主要探討缺氧對(duì)大鼠心肌細(xì)胞造成的損傷及引起損傷的機(jī)制，為心力衰竭等疾病的臨床治療積累理論資料。
　　方法：
　?。?）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組：以大鼠心肌細(xì)胞株（H9C2）為材料，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組條件為1%O2+5%CO2+94%N2、37℃條件下三氣培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)；對(duì)照組條件為95%Air、5%CO2、37℃ CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)。分別設(shè)3h、6h、12h、24h、48h時(shí)段取材，觀察細(xì)胞的各項(xiàng)指

2、標(biāo)。
　　（2）細(xì)胞的生長(zhǎng)及活力的觀察：分段取材使用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)其染色，使用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；利用ELISA法和 CCK-8試劑盒檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的OD值來(lái)判斷細(xì)胞活力；使用細(xì)胞實(shí)時(shí)觀測(cè)儀（Cellasic）在不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)連續(xù)觀測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)變化情況以及缺氧對(duì)細(xì)胞造成的損傷狀態(tài)。
　　（3）線粒體功能檢測(cè)：對(duì)培養(yǎng)24h時(shí)兩組細(xì)胞取材并固定切片，利用透射電鏡觀察不同缺氧時(shí)間下改變；使用活性氧檢測(cè)試劑盒通過(guò)流式

3、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)下細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的變化；以線粒體呼吸鏈中核心蛋白線粒體色素C為靶蛋白，通過(guò)Western blot法檢測(cè)各時(shí)間段的表達(dá)水平，以此判斷對(duì)線粒體的損傷程度。
　?。?）細(xì)胞凋亡的觀察：利用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞各時(shí)期的吸光度來(lái)驗(yàn)證凋亡因子caspase3的活性程度；使用熒光染料Hoest33342對(duì)0h、24h、48h的兩組細(xì)胞進(jìn)行染色，借助熒光顯微鏡直觀判斷細(xì)胞的凋亡情況；使用7-AAD及Annexin V-APC

4、對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記再利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各時(shí)間段兩組細(xì)胞的早期凋亡率。
　?。?）細(xì)胞壞死的觀察：使用 ELISA法檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）在各時(shí)間段的表達(dá)程度，以此為指標(biāo)判斷細(xì)胞壞死程度。
　　結(jié)果：
　?。?）細(xì)胞的生長(zhǎng)及活力的觀察：通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀觀察隨著缺氧時(shí)間的增加，心肌細(xì)胞生長(zhǎng)速率不斷減慢。與對(duì)照組相比，24h時(shí)兩組細(xì)胞生長(zhǎng)差異最大，缺氧24h組比對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)率下降了1.53倍（P<0.01）。使用CCK-8試劑

5、盒檢測(cè)出隨著缺氧時(shí)間的增加，心肌細(xì)胞存活率均明顯降低。6h時(shí)兩組細(xì)胞生長(zhǎng)差異最大，缺氧6h組比對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)率下降了1.53倍（P<0.01）。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)缺氧6小時(shí)后心肌細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生改變，缺氧12小時(shí)后心肌細(xì)胞的胞質(zhì)出現(xiàn)空泡和細(xì)胞皺縮，缺氧48小時(shí)細(xì)胞基本全部死亡。
　?。?）線粒體功能檢測(cè)：透射電鏡下缺氧24小時(shí)可見心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)明顯損傷。缺氧6小時(shí)開始，ROS釋放水平開始升高，24h兩組細(xì)胞內(nèi)ROS

6、水平差異最大，缺氧24h組細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)水平升高了7.59倍（P<0.01）。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C含量在缺氧3小時(shí)處開始出現(xiàn)差異，與正常組比較，缺氧3h組細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)水平升高了0.79倍（P<0.01）。與缺氧12h組比較，缺氧24h組細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)水平升高了0.41倍（P<0.01）。
　　（3）細(xì)胞凋亡的觀察：隨著缺氧時(shí)間的增加，caspase-3活性水平也不斷增加，缺氧3小時(shí)處開始出現(xiàn)差異，與正常組比較，缺氧3

7、h組caspase-3活性水平升高了0.67倍（P<0.01）。缺氧48小時(shí)活性最高，與缺氧24h組比較，缺氧48h組caspase-3活性水平升高了0.27倍（P<0.01）。通過(guò)熒光顯微鏡觀察到，缺氧培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞缺氧處理24h、48h后，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)反映出隨著缺氧時(shí)間的不斷增加心肌細(xì)胞的早期凋亡率明顯增加。缺氧24h細(xì)胞凋亡率最高，與正常組比較，缺氧24h組細(xì)胞凋亡水平升高了14.14倍（P<0