BMP-2聯(lián)合IGF-I體外干預(yù)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　 目的:熟練掌握骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定方法，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　 方法:用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，在體外培養(yǎng)并傳代。用免疫組化法及流式細(xì)胞檢測技術(shù)對第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，檢測其細(xì)胞表面抗原CD34、CD44及CD90的表達(dá)，用MTT法檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖情況并繪制細(xì)胞生長曲線。
　　 結(jié)果:骨髓間

2、充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)后貼壁生長，胞漿含有較大的顆粒，核卵圓形，細(xì)胞呈多角形、梭形，有多個(gè)大小不一的突起，細(xì)胞分裂相多見，細(xì)胞生長曲線示細(xì)胞生長狀態(tài)良好。免疫組化法及流式細(xì)胞儀對第三代基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)鑒定結(jié)果為:CD44抗原表達(dá)陽性，CD90陽性率:95.5％，CD34陽性率:0.21％，符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　 結(jié)論:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞容易獲取、來源充足、可以大量傳代擴(kuò)增，加入誘導(dǎo)液后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變并可向軟骨細(xì)胞分化，可作為軟骨

3、組織工程的種子細(xì)胞。
　　 第二部分GFP基因轉(zhuǎn)染，干預(yù)誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞方向分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)利用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染標(biāo)記;探討在體外不同的生長因子誘導(dǎo)下鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)向成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力，建立適合軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化條件的培養(yǎng)基，為軟骨組織工程種子細(xì)胞的研究提供理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:取第三代BMSC用含BMP-2(骨形態(tài)發(fā)生

4、蛋白-2)和IGF-Ⅰ（胰島素樣生長因子-Ⅰ）誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基在單層細(xì)胞培養(yǎng)模式下觀察其向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力，實(shí)驗(yàn)分為GFP轉(zhuǎn)染組，未轉(zhuǎn)染組。GFP轉(zhuǎn)染組又分為四組:BMP-2(100ng/ml)誘導(dǎo)組，IGF-Ⅰ(10ng/ml)誘導(dǎo)組，IGF-Ⅰ，BMP-2(100ng/ml，10ng/ml)聯(lián)合誘導(dǎo)組，未加任何生長因子組.未轉(zhuǎn)染組同樣也分為四組:BMP-2誘導(dǎo)組，IGF-Ⅰ誘導(dǎo)組，IGF-Ⅰ和BMP-2聯(lián)合誘導(dǎo)組，未加任何生長

5、因子組。用免疫組化法及流式細(xì)胞檢測技術(shù)對第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，檢測CD34、CD44及CD90細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，用MTT法檢測BMSC的增殖情況并繪制細(xì)胞生長曲線，經(jīng)過14天誘導(dǎo)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光表達(dá)，用免疫組化法檢查Ⅱ型膠原表達(dá);用二甲基亞甲蘭(DMB)比色法定量檢測糖胺聚糖(GAG)的分泌，用阿利新藍(lán)染色檢查糖胺聚糖的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、各誘導(dǎo)組中阿利新藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫組化均成陽性表

6、達(dá)，且IGF-Ⅰ，BMP-2聯(lián)合誘導(dǎo)組糖胺聚糖(GAG)的分泌量高于同組中其它各組，但轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組中IGF-Ⅰ，BMP-2聯(lián)合誘導(dǎo)組糖胺聚糖(GAG)的分泌量沒有顯著性差異。
　　 2、轉(zhuǎn)染GFP組可在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、1周、2周、3周、4周時(shí)在熒光顯微鏡下可表達(dá)綠色熒光，且GFP基因轉(zhuǎn)染后對BMSC的增殖分化無顯著性影響。
　　 結(jié)論:
　　 1、IGF-Ⅰ和BMP-2可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)向軟骨

7、細(xì)胞方向分化，且二者聯(lián)合作用對BMSC向軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化有明顯的促進(jìn)作用。在DMEM培養(yǎng)基中加入IGF-Ⅰ和BMP-2可作為一種理想的軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基。
　　 2、GFP基因的導(dǎo)入對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的活性和生物學(xué)特性無顯著性影響，且綠色熒光可在細(xì)胞內(nèi)長期表達(dá)。綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記技術(shù)轉(zhuǎn)染標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)可作為一套細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)追蹤研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的生物學(xué)變化（如遷移定植、