未成熟卵體外成熟技術(shù)對(duì)小鼠腎臟腎素—血管緊張素系統(tǒng)基因表達(dá)和甲基化修飾的影響.pdf

1、目的:研究IVM小鼠腎臟RAS系統(tǒng)基因如Agt、Ace、Ren1、Ren2、Agtr-1a、Agtr-1b、Ace2、Agtr2和微小RNAs(Micro-RNA，MiRNAs)的表達(dá)、以及Agt和Ace的甲基化狀況，闡明IVM對(duì)出生小鼠血壓調(diào)控相關(guān)機(jī)制的影響。
　　材料和方法:
　　1.利用C57BL/6J小鼠，通過(guò)單純注射孕馬血清獲取未成熟卵，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)、ICSI輔助受精和胚胎移植等方法建立IVM小鼠模型。通過(guò)注射孕

2、馬血清和人絨毛膜促性腺激素獲取成熟卵，經(jīng)ICSI輔助受精和胚胎移植等方法建立體內(nèi)成熟小鼠模型(CON)，出生小鼠飼養(yǎng)至10周及1.5年時(shí)，分別處死獲取兩組小鼠的腎臟組織。
　　2.通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)10周及1.5年兩組小鼠腎臟組織RAS基因如Agt、Ace、Ren1、Ren2、Agtr-1a、Agtr-1b、Ace2、Agtr2和miRNAs(miRNA698,miRNA27a，miRNA155和miRNA143)的表達(dá)

3、。
　　3.利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)兩組小鼠兩個(gè)時(shí)期腎臟組織Agt和Ace的各位點(diǎn)的甲基化情況。
　　4.通過(guò)western-blot技術(shù)，檢測(cè)兩組小鼠兩個(gè)時(shí)期腎臟組織AGT、ACE、ACE2和AGTR1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.IVM對(duì)出生后子代腎臟組織RAS系統(tǒng)各基因表達(dá)的影響
　　(1)10周，兩組小鼠腎臟組織RAS系統(tǒng)各基因表達(dá)分析
　　10周時(shí)，與體內(nèi)成熟小鼠相比，IVM小鼠腎臟組織A

4、gt、Ace、Ren1、Ren2和Agtr-1b表達(dá)水平顯著升高，Agtr-1a和Ace2表達(dá)水平顯著下降，而Agtr-2的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，IVM小鼠腎臟組織miRNA-698、miRNA-27a和miRNA-155的表達(dá)較體內(nèi)成熟小鼠顯著性增高;但兩組間的miRNA-143的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)1.5年，兩組小鼠腎臟組織RAS系統(tǒng)各基因表達(dá)分析
　　1.5年時(shí)，與體內(nèi)成熟小鼠相比，IVM小鼠腎臟組

5、織Agt和Ace表達(dá)水平顯著升高，Ren1、Agtr-1a、Agtr-1、Ace2和Agtr-2表達(dá)水平顯著下降，而Ren2的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，IVM小鼠腎臟組織miRNA-698、miRNA-27a和miRNA-143的表達(dá)較體內(nèi)成熟小鼠顯著增高，miRNA-155表達(dá)顯著降低。
　　2.IVM對(duì)出生后子代腎臟Agt和Ace甲基化修飾影響
　　依據(jù)上述Agt及Ace的長(zhǎng)期表達(dá)差異，選取Agt的3個(gè)甲基化位點(diǎn)和Ac

6、e的4個(gè)甲基化位點(diǎn)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。
　　(1)10周兩組小鼠腎臟組織Agt和Ace的甲基化狀態(tài)分析
　　10周時(shí)，相較于體內(nèi)成熟小鼠之間，IVM小鼠腎臟組織Agt的CpG2位點(diǎn)甲基化率顯著性降低，Ace的CpG1和CpG2位點(diǎn)甲基化率顯著性升高。而兩組小鼠腎臟組織Agt及Ace其他CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　(2)1.5年兩組小鼠腎臟組織Agt和Ace的甲基化狀態(tài)分析
　　1.5年，IVM小鼠腎臟組織

7、Ace的CpG1甲基化率低于體內(nèi)成熟小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而兩組小鼠腎臟組織Agt和Ace其他CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.IVM對(duì)出生后子代腎臟組織AGT、ACE、ACE2和AGTR-1蛋白表達(dá)的影響
　　相較于體內(nèi)成熟組，10周IVM小鼠腎臟組織AGT蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但到1.5年時(shí)，IVM小鼠腎臟組織AGT蛋白表達(dá)水平增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在10w和1.5y兩個(gè)時(shí)間段，兩組