小鼠未成熟卵孤雌胚胎干細胞系的建立及其印跡基因的研究.pdf

1、胚胎干細胞具無限增殖和多向分化潛能，在發(fā)育生物學的研究、新基因的發(fā)現(xiàn)和功能研究以及組織器官移植重建等領(lǐng)域都具有重要的科學意義、巨大的醫(yī)學應(yīng)用價值及經(jīng)濟效益。但是由于胚胎干細胞材料主要是來源于胚胎，因而必須面對損毀生命的倫理學爭議和應(yīng)用于臨床治療時出現(xiàn)的免疫排斥問題。目前一方面是可提供的人類卵子有限，一方面是生殖醫(yī)學中心存在大量廢棄的未成熟卵子。孤雌胚胎干細胞是解決這兩個問題的有效途徑。本研究旨在建立一小鼠未成熟卵分離孤雌胚胎干細胞系實驗

2、模型，為將來構(gòu)建高效穩(wěn)定的應(yīng)用于人未成熟卵分離孤雌干細胞技術(shù)平臺；并初步探索印跡基因在孤雌胚胎干細胞中的表達和作用。
　　 本課題首先是建立了一未成熟卵培養(yǎng)體系，通過氯化鍶和細胞松弛素D聯(lián)合孤雌激活得到高效率的囊胚發(fā)育，并進一步摸索了一套適合未成熟卵孤雌干細胞分離培養(yǎng)的方法。分離到具有較強分化潛能的孤雌胚胎干細胞，尤其是其生殖系轉(zhuǎn)移效率遠遠高于以往有關(guān)孤雌干細胞生殖系轉(zhuǎn)移效率的報導?？紤]孤雌干細胞來源于未成熟卵，對未成熟卵及其孤

3、雌囊胚和干細胞從印跡基因甲基化和表達上做了進一步的機制探討。具體研究內(nèi)容包括以下四部分：
　　 通過對小鼠未成熟卵體外成熟和孤雌激活，發(fā)現(xiàn)B6C3F1未成熟卵培養(yǎng)成熟后孤雌激活囊胚率為86％，低于對照組體內(nèi)成熟卵孤雌激活囊胚率100％； B6129Fl未成熟卵培養(yǎng)成熟后孤雌激活囊胚率為65％，低于對照組體內(nèi)成熟卵孤雌激活囊胚率98％。
　　 小鼠未成熟卵孤雌囊胚移植在MEF上后，原代生長培養(yǎng)和傳代：改良培養(yǎng)體系，用含KS

4、R的干細胞培養(yǎng)液代替FBS干細胞培養(yǎng)液在B6C3F1品系中成功地分離到17株未成熟卵孤雌干細胞，其中用含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液分離了11株，效率為11％；KSR的培養(yǎng)液分離了6株，其效率為42.9％。在B6129F1品系中，用KSR的培養(yǎng)液分離到7株，其分離效率為21.2％。用KSR的培養(yǎng)液分離效率高于FBS的培養(yǎng)液分離效率。
　　 對未成熟卵孤雌激活分離的干細胞進行多能性的相關(guān)鑒定。小鼠未成熟卵孤雌干細胞系1116核型正常，具有干細胞

5、系有關(guān)的生物學特征，體外擬胚體實驗和體內(nèi)畸胎瘤實驗都證明其能向胚胎發(fā)育的三個胚層分化。另外1116pES(B6C3F1品系)和11191pES(B6129F1品系)嵌合體生殖系轉(zhuǎn)移實驗證明未成熟卵孤雌干細胞是具有較高的生殖系轉(zhuǎn)移效率，接近于正常受精干細胞系的生殖系轉(zhuǎn)移效率。
　　 小鼠未成熟卵孤雌干細胞印跡基因和甲基化狀態(tài)方面的研究發(fā)現(xiàn)：1、體外未成熟卵Impact基因的mRNA表達的量高于體內(nèi)成熟卵的表達量；2、未成熟卵來源孤

6、雌囊胚H19表達量低于成熟卵孤雌囊胚，但二者都高于正常受精囊胚，孤雌囊胚Snrpn和Slc38a4不表達或表達偏低；3、未成熟卵來源的孤雌胚胎干細胞IVM1116pES和成熟卵來源干細胞C3pES中H19表達量都高于正常受精胚胎干細胞BF10，但IVM1116pES中H19表達量更趨于接近BF10表達量；4、H19基因DMR區(qū)從卵子到孤雌囊胚、孤雌生殖干細胞基本為未甲基化狀態(tài)，而Snrpn在卵子完全甲基化到孤雌囊胚少量去甲基化；1116