人卵泡發(fā)育超微結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)譜的研究及未成熟卵體外培養(yǎng)的臨床應(yīng)用.pdf

1、對卵母細(xì)胞和卵泡發(fā)育、成熟機(jī)制的研究是人類揭示自身繁衍的奧秘、提高人口素質(zhì)的需要.自從20世紀(jì)30年代以來,隨著物理化學(xué)技術(shù),尤其是電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)明和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,打破了光學(xué)顯微研究細(xì)胞的局限而進(jìn)入了超微結(jié)構(gòu)和分子生物水平的領(lǐng)域,為包括生殖細(xì)胞的來源、原始生殖細(xì)胞分化、始基卵泡由靜止池進(jìn)入生長發(fā)育階段的動(dòng)因、初級(jí)卵泡發(fā)育為次級(jí)卵泡和成熟卵泡過程的形態(tài)學(xué)變化規(guī)律和內(nèi)分泌環(huán)境、自分泌和旁分泌作用等研究提供了技術(shù)平臺(tái).

2、在卵泡/卵母細(xì)胞的發(fā)育過程中卵巢局部的微環(huán)境參與了整個(gè)過程,有研究發(fā)現(xiàn)卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的抑制素A、抑制素B和激活素A是卵母細(xì)胞成熟基本細(xì)胞因子,胰島素樣生長因子Ⅰ/Ⅱ、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長岡子、骨形成蛋白、生長與分化岡子、腫瘤壞死因子、白介素、抗苗勒管激素、卵細(xì)胞成熟抑制因子、有絲分裂原激活蛋白激酶、促成熟因子、連接蛋白43、生長與分化激素、妊娠相關(guān)血漿蛋白a、血管上皮生長因子、磷脂酰肌醇3激酶(P13K)等對卵母細(xì)胞/卵泡發(fā)育的啟動(dòng)

3、、生長、成熟起著極為重要的作用,當(dāng)上述物質(zhì)缺失或編碼基因突變將導(dǎo)致卵細(xì)胞或卵泡發(fā)育、成熟障礙.雖然已明確了卵泡發(fā)育的基本形態(tài)學(xué)改變和FSH、LH、T、E<,2>等激素的周期性變化,并對影響卵母細(xì)胞成熟的卵巢內(nèi)微環(huán)境岡素的研究取得了一定的進(jìn)展,嘗試在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中添加上述的某些物質(zhì),但仍未達(dá)到生理狀態(tài)的成熟.卵池/卵母細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育、成熟過程極為復(fù)雜,包含其中的分子可能有數(shù)十種、數(shù)百種、甚至數(shù)千種?由于卵泡壁層顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞、卵

4、丘顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間眾多生長因了、細(xì)胞因子的相互調(diào)節(jié)作用機(jī)制仍未完全清楚,對于ART及其衍生技術(shù)的不斷涌現(xiàn),卵泡和卵母細(xì)胞受超生理劑量的促性激素和性激素的影響以及在體外培養(yǎng)過程中的一系列超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化更缺乏了解.因此,我們試圖從未成熟卵泡和成熟卵泡顆粒細(xì)胞基因表達(dá)差異、卵細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變研究卵母細(xì)胞、卵泡生長、發(fā)育、成熟機(jī)制,分析參與卵母細(xì)胞/卵泡成熟的相關(guān)因素,獲取卵母細(xì)胞成熟的相關(guān)信息,為建立合理的IVM體系提供理論

5、支持,探索未成熟卵獲取周期準(zhǔn)備方案、取卵時(shí)機(jī)和體外培養(yǎng)條件. 一、人未成熟卵和成熟卵卵丘復(fù)合物超微結(jié)構(gòu)研究 目的：觀察人卵丘復(fù)合物(oocyte-cumulus complex,OCCs)在體內(nèi)和體外從未成熟發(fā)育至成熟的超微結(jié)構(gòu)變化,并比較自然狀態(tài)和常規(guī)促排卵IVF/ICSI周期未成熟OCCs超微結(jié)構(gòu)的區(qū)別,分析不同條件和環(huán)境對卵細(xì)胞質(zhì)量的影響. 方法: 用光鏡分辨生發(fā)泡期(GV期)、生發(fā)泡破裂期(M

6、Ⅰ期)的米成熟卵和達(dá)到M Ⅱ期的成熟卵.標(biāo)本來自婦科腹腔鏡手術(shù)的自然周期、IVF/ICSI周期、IVM周期捐贈(zèng)的卵丘復(fù)合物(OCCs).對婦科腹腔鏡手術(shù)的自然周期未成熟卵(GV期)、促排卵周期未成熟卵(GV/MI)、促排卵周期體內(nèi)成熟卵(MII)、體外成熟培養(yǎng)成熟卵(MII)各3枚,分別經(jīng)透射電鏡技術(shù)處理,觀察OCCs的超微結(jié)構(gòu). 結(jié)論： 1.經(jīng)常規(guī)促排卵的IVF/ICSI周期,在大部分卵母細(xì)胞成熟的情況下產(chǎn)生的GV期卵

7、丘復(fù)合物,由于受超生理劑量FSH以及hCG的影響,卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞連接松散,將導(dǎo)致卵母細(xì)胞過早缺乏顆粒細(xì)胞通過縫隙連接輸送的營養(yǎng)以及卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒過早出現(xiàn),可能是受精率和胚胎發(fā)育能力下降的原因.超生理狀態(tài)的激素環(huán)境將影響發(fā)育延遲卵母細(xì)胞體外成熟的能力.因此,來自于常規(guī)促排卵周期的GV卵不適合進(jìn)一步的培養(yǎng),用于胚胎移植. 2.促排卵周期MI期卵丘細(xì)胞呈旺盛的增殖和功能活動(dòng)狀態(tài),卵母細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)、皮質(zhì)顆粒、透明帶等已發(fā)生了適

8、合于卵母細(xì)胞成熟的顯著的形態(tài)學(xué)改變,為卵母細(xì)胞成熟做好的充分的準(zhǔn)備,具有進(jìn)一步發(fā)育的潛能. 3.經(jīng)體外成熟母細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,線粒體數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)模糊,脂滴減少,皮質(zhì)顆粒減少,而且卵丘顆粒細(xì)胞凋亡改變明顯,可能是卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、使其進(jìn)一步發(fā)育能力受損的原因. 二、人類未成熟卵泡和成熟卵泡顆粒細(xì)胞基因表達(dá)差異 目的：分析人未成熟卵泡和成熟卵泡顆粒細(xì)胞基因表達(dá)差異,探討卵泡顆粒細(xì)胞在卵泡/卵母細(xì)胞成熟過程中可能參

9、與的分子機(jī)制. 方法:獲取IVM周期未成熟卵泡(直徑5～12mm)的卵泡液和常規(guī)促排卵IVF周期成熟卵(直徑≥14mm)的卵泡液,分離顆粒細(xì)胞,抽提、純化mRNA.將未成熟卵泡顆粒細(xì)胞設(shè)為研究組,成熟卵泡顆粒細(xì)胞設(shè)為對照組,采用含8300個(gè)人類基因的基因芯片進(jìn)行差異性表達(dá)研究,并對其中有差異性表達(dá)的10個(gè)基因采用熒光實(shí)時(shí)定量技術(shù)(Real-time RT-PCR)進(jìn)行驗(yàn)證. 結(jié)論： 1.經(jīng)包含8300個(gè)基因位點(diǎn)

10、的人表達(dá)譜基因芯片篩企,竇卵泡發(fā)育中期(直徑5～12mm)的未成熟卵泡顆粒細(xì)胞和成熟卵泡顆粒細(xì)胞存在462個(gè)差異表達(dá)基岡,說叫人類卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟過程受顆粒細(xì)胞所分泌的一系列物質(zhì)時(shí)空上的調(diào)控密切相關(guān). 2.對基因芯片結(jié)果比率不同的10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行Real-time RT-PCR驗(yàn)證,除1個(gè)基因無顯著差異外,其余均有顯著差異,符合率達(dá)90﹪.提示本實(shí)驗(yàn)基因芯片的可信度,我們可以根據(jù)基因芯片的結(jié)果進(jìn)行基因表達(dá)產(chǎn)物及其功能的進(jìn)

11、一步研究. 3.經(jīng)基因芯片篩查未成熟卵泡顆粒細(xì)胞和成熟卵泡顆粒細(xì)胞存在190個(gè)基因上調(diào)表達(dá),272個(gè)基因下調(diào)表達(dá).說明隨著卵泡的發(fā)育、成熟,有更多的調(diào)節(jié)兇子參與,顆粒細(xì)胞在卵泡成熟階段所具有的功能更復(fù)雜. 4.分析未成熟卵泡和成熟卵泡顆粒細(xì)胞差異表達(dá)基兇,提示不同卵泡發(fā)育階段顆粒細(xì)胞所起的作用不同.未成熟卵泡顆粒細(xì)胞主要是以促進(jìn)細(xì)胞增殖、雌激素分泌和縫隙連接等基因表達(dá)占優(yōu)勢;成熟卵泡顆粒細(xì)胞主要與孕激素分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物

12、質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞外基質(zhì)和粘液分泌等細(xì)胞功能相關(guān)基因表達(dá)占優(yōu)勢. 5.基因芯片結(jié)果提示不同卵泡發(fā)育階段顆粒細(xì)胞產(chǎn)生不盡相同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、生長因子、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子、旁分泌因子和能量物質(zhì)作用于卵母細(xì)胞,調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟,或接受卵母細(xì)胞分泌的物質(zhì)發(fā)生功能上的改變. 6.芯片結(jié)果提示除了與既往研究相一致的在卵泡發(fā)育過程中的基因優(yōu)勢表達(dá)和功能外,尚有許多在卵泡發(fā)育、成熟過程中功能未明的基因有待進(jìn)一步研究.對這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物和功能

13、的研究將有助于增加我們對卵泡/卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟機(jī)理的全面了解. 三、人類卵子體外成熟--體外受精-胚胎移植-冷凍復(fù)蘇 目的：觀察取卵周期準(zhǔn)備、卵泡直徑、IVM培養(yǎng)液成分和培養(yǎng)時(shí)間對未成熟卵的獲取率、成熟率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率、妊娠率和出生率及其胚胎冷凍復(fù)蘇移植的影響. 方法： 以2002年7月～2004年7月在本院生殖中心進(jìn)行卵子體外成熟的不孕不育患者為研究對象.以自然周期+絨毛膜促性腺

14、激素(hCG),或單用尿促卵泡素(HMG)+hCG,或常規(guī)促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長方案促排卵周期由于有卵巢過度刺激傾向而改為卵子體外成熟(IVM)周期獲取未成熟卵.取卵時(shí)最大卵泡直徑10～13.5mm不等,分別以TCM199或人輸卵管液(HTF)為基礎(chǔ)培養(yǎng)液,分別加入10﹪人血清蛋白(PPF) 或10﹪合成血清物質(zhì)(SSS),再添加0.075 IU/ml r-FSH+0.5IU/mL hCG+1μg/mlβE2于上述I

15、VM培養(yǎng)液中,觀察取卵周期準(zhǔn)備、卵泡直徑、IVM培養(yǎng)液成分對未成熟卵的獲取率、成熟率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率、妊娠率和出生率及其胚胎冷凍復(fù)蘇移植結(jié)局. 結(jié)論： 1.IVM周期取卵時(shí)卵泡大小不均一且最大卵泡直徑≥12mm時(shí),受精率和胚胎質(zhì)量下降,將影響胚胎著床率和累積妊娠率. 2.以TCM199為基礎(chǔ)培養(yǎng)液能提高未成熟卵體外成熟后受精卵所形成胚胎的發(fā)育能力和著床率,但仍低于常規(guī)IVF周期的著床率.