發(fā)酵法生產(chǎn)米多霉素的菌種選育、培養(yǎng)條件優(yōu)化和動力學(xué)研究.pdf

1、米多霉素是一種由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的核苷類抗生素，對真菌細(xì)胞具有強(qiáng)烈的抑制及殺死作用，特別是對農(nóng)作物的白粉病有很好的防治效果，而且具有高效、低毒等特點(diǎn)。米多霉素已經(jīng)在國外實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)，我國還未進(jìn)行研究。本論文以提高發(fā)酵法生產(chǎn)米多霉素的水平為目標(biāo)，對米多霉素發(fā)酵的菌種改造、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化及發(fā)酵動力學(xué)等進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，大幅度提高了米多霉素的產(chǎn)量，為發(fā)酵法生產(chǎn)米多霉素的工業(yè)化奠定了良好的基礎(chǔ)。 本論文取得了如下主要進(jìn)展：

2、建立了以紅酵母AS2.166為敏感菌、土豆葡萄糖培養(yǎng)基(pH7.0)為檢定培養(yǎng)基的米多霉素生物檢定法?；谶@一生物檢定技術(shù)，設(shè)計(jì)出簡便易行、成本低廉、省時省力的瓊脂塊初篩法，并用于米多霉素產(chǎn)生菌的高通量篩選。 根據(jù)米多霉素的生物合成途徑，對米多霉素野生型產(chǎn)生菌MIL01進(jìn)行推理選育，獲得了一株米多霉素高產(chǎn)菌MIL29，米多霉素產(chǎn)量達(dá)到了1010mg/L，為出發(fā)菌株MIL01產(chǎn)量的2.6倍。 對米多霉素產(chǎn)生菌MIL29的原

3、生質(zhì)體制備和再生條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最適條件下，原生質(zhì)體的濃度和再生率均比優(yōu)化前提高了約1.6倍?？疾炝瞬煌瑵舛群筒煌肿恿康木垡叶紝υ|(zhì)體融合頻率的影響，結(jié)果表明，40％的聚乙二醇6000是最適的融合劑，最適融合時間為5min。對MIL29的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理后獲得菌株MIL32，米多霉素產(chǎn)量較MIL29提高了約9％。 基于全基因組重排理論，通過兩輪的多親本原生質(zhì)體融合獲得了高產(chǎn)菌株MIL89，米多霉素產(chǎn)量分別比MIL32

4、提高了約77％，達(dá)到了1950mg/L。 篩選獲得了多種促進(jìn)米多霉素生物合成的前體物質(zhì)，其中80mmol/LN,N-二甲基乙酰胺和150mmol/L氯化膽堿組成的復(fù)合前體能加快糖、氨基氮的消耗速度和米多霉素的合成速度，促使米多霉素的合成時間提前，將米多霉素產(chǎn)量提高至少12％。利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法考察了培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件對米多霉素生物合成的影響，從10個因素中選出3個對米多霉素生物合成最為重要的因素：玉米淀粉

5、、氯化膽堿和N，N-二甲基乙酰胺。響應(yīng)曲面分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了氯化膽堿和N,N-二甲基乙酰胺對米多霉素生物合成具有協(xié)同促進(jìn)作用。在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下獲得米多霉素的搖瓶產(chǎn)量達(dá)到2607mg/L，比優(yōu)化前提高了13％。 在10L攪拌式發(fā)酵罐中考察了米多霉素的間歇發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵和流加發(fā)酵特征。實(shí)驗(yàn)表明，分批補(bǔ)料發(fā)酵可以解決間歇發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)耗竭所導(dǎo)致的米多霉素合成受限問題，米多霉素產(chǎn)量比間歇發(fā)酵提高了約38％。流加發(fā)酵彌補(bǔ)了分批