L-精氨酸生產(chǎn)菌種的選育及發(fā)酵條件研究.pdf

1、L-精氨酸(L-Arginine，L-Arg)也稱精氨酸，是一種具有胍基的堿性氨基酸。它還是一種半必須氨基酸，機(jī)體能自身合成，但處于生長(zhǎng)發(fā)育的兒童和在應(yīng)急狀態(tài)時(shí)，需要補(bǔ)充外源的L-Arg。L-Arg是20種氨基酸之一，是合成蛋白質(zhì)和肌酸的原料，是尿素循環(huán)的主要代謝產(chǎn)物。最近的研究表明，L-Arg能降低膽固醇的含量，增強(qiáng)血管的彈性，具有抗動(dòng)脈硬化的作用，輔助治療冠狀動(dòng)脈硬化疾病。1998年，L-Arg一氧化氮途徑的發(fā)現(xiàn)使得L-Arg的研究

2、成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。在L-Arg/NO途徑中，L-Arg通過(guò)能增強(qiáng)血管細(xì)胞中NO的合成緩慢限制升高的血壓，起到舒張血管和增加血流的作用。L-Arg是合成NO的底物，又是藥用氨基酸生產(chǎn)的“瓶頸”產(chǎn)品之一，因此在醫(yī)藥工業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。 選育性能優(yōu)良的、具有強(qiáng)大的L-Arg合成酶系的菌株是發(fā)酵法生產(chǎn)L-Arg的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。L-Arg是不分枝合成途徑的產(chǎn)物，這一途徑有八步反應(yīng)，需要八個(gè)酶催化，并且L-Arg本身就是其合成途徑的調(diào)節(jié)因子

3、。谷氨酸是L-Arg合成的前體，L-Arg生產(chǎn)菌經(jīng)過(guò)鳥(niǎo)氨酸和瓜氨酸合成L-Arg。因此選育L-Arg生產(chǎn)菌需考慮菌株能否合成L-谷氨酸，且能解除自身的反饋抑制，喪失L-Arg分解能力的突變株十分重要，確定合適的發(fā)酵條件，以大量積累L-Arg。 本研究通過(guò)物理化學(xué)相結(jié)合的誘變方法，獲得抗L-Arg結(jié)構(gòu)類(lèi)似物突變株，根據(jù)突變株的生理生化特征，設(shè)計(jì)合理的發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，提高L-Arg生產(chǎn)菌的產(chǎn)酸水平，為工業(yè)化生產(chǎn)

4、奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)我國(guó)氨基酸工業(yè)的發(fā)展，改變我國(guó)L-Arg生產(chǎn)的被動(dòng)局面。 本研究以北京棒桿菌AS1.299為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行物理化學(xué)逐級(jí)誘變，逐級(jí)篩選。研究了物理化學(xué)誘變的條件，確定紫外誘變條件為30W紫外燈照射菌懸液25s?；瘜W(xué)誘變條件為1％硫酸二乙酯處理30min。復(fù)合誘變條件為紫外照射15s后立即用1％硫酸二乙酯處理20min。獲得一株具有三重抗性的突變株。以含有L-Arg結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，如D-精氨酸、S-甲基半胱氨酸、L-同

5、型精氨酸鹽酸鹽的瓊脂平板作為篩選平板，通過(guò)濃度剃度法理性篩選抗性菌株，比較不同階段獲得的幾株抗性突變株的產(chǎn)酸水平，篩選到一株L-Arg結(jié)構(gòu)類(lèi)似物多種抗性的突變株FHA0055(SMCr，D-Argr，L-HAr)，初步搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸水平為4.14g/L。該突變株為G+，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，不能發(fā)酵乳糖，MR陽(yáng)性，VP陰性。 培養(yǎng)基中碳氮比和發(fā)酵條件對(duì)L-Arg生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)和L-Arg積累有非常重要的影響。試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中的碳氮比進(jìn)行

6、研究，確定較合適碳氮比為100∶32.5。正交試驗(yàn)確定了最優(yōu)的發(fā)酵條件，250mL三角瓶裝80mL發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度32℃，搖瓶轉(zhuǎn)速控制120r/min，pH7.0，接種量5％，發(fā)酵時(shí)間為76h，產(chǎn)酸水平15.34g/L，是出發(fā)菌株的18倍。 實(shí)驗(yàn)研究了發(fā)酵液中L-Arg的定量測(cè)定方法，確定了分光光度法測(cè)定適合條件。 在5L全自動(dòng)發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵液裝量為3L，培養(yǎng)基中含糖10％，6％(NH4)2SO4，0.1