發(fā)酵法生產(chǎn)聚賴氨酸菌種選育研究.pdf

1、近幾年，隨著食品安全問題的頻頻曝光，食品安全的重要性引起政府高度重視和人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注，其中食品的防腐保鮮是食品安全關(guān)鍵問題之一。ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一種由L-賴氨酸以ε-酰胺鍵連接而成的聚合物，具有水溶性強(qiáng)、抑菌譜廣、可生物降解、對(duì)人體沒有任何毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前最具優(yōu)良性能和商業(yè)價(jià)值的生物防腐劑之一，已被包括美國、日本等多個(gè)國家批準(zhǔn)作為食品防腐劑，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域。目前，發(fā)酵法生產(chǎn)ε-PL在

2、日本已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，而我國大多仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，主要的問題之一就是ε-PL生產(chǎn)菌株的產(chǎn)率不高，還不具有市場(chǎng)競爭能力，因此選育高產(chǎn)ε-PL菌株，對(duì)于我國早日實(shí)現(xiàn)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL，以滿足市場(chǎng)需求具有積極意義。
　　本論文采用改良的Nishikawa篩選方法，結(jié)合ε-PL能與Dragendorff試劑和甲基橙試劑發(fā)生特異性沉淀反應(yīng)的特性，篩選出5株產(chǎn)ε-PL菌株。采用Itzhaki方法，測(cè)定菌株ε-PL產(chǎn)量，其中菌株SAC23的ε

3、-PL產(chǎn)量最高，達(dá)到1.893g/L。提取純化SAC23的發(fā)酵產(chǎn)物做抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)革蘭氏陽性菌、陰性菌以及真菌都有抑菌效果;薄層層析確定發(fā)酵產(chǎn)物為ε-PL; SDS-PAGE電泳測(cè)得ε-PL相對(duì)分子量約為3.4KDa，聚合度約為27。通過對(duì)該菌株的形態(tài)觀察、生理生化分析以及16S rRNA分子鑒定，初步確定菌株SAC23為Streptomyces ahygroscopicus（不吸水性鏈霉菌）。
　　以SAC23為出發(fā)菌株，通

4、過60Coγ-射線照射誘變育種，結(jié)合核糖體工程與亞甲基藍(lán)平板篩選，在329株突變株中篩選獲得兩株ε-PL產(chǎn)量分別達(dá)到4.111g/L和4.384g/L的高產(chǎn)突變株SAS12和SAS17，比原始出發(fā)株SAC23分別提高117.2％和131.6％。將高產(chǎn)突變株連續(xù)傳代10次后，ε-PL產(chǎn)量變化在1％以內(nèi)，說明這兩株菌遺傳穩(wěn)定。以SAS12和SAS17為出發(fā)菌株，進(jìn)行原生質(zhì)體融合育種，根據(jù)在亞甲基藍(lán)平板上產(chǎn)生的透明圈大小，從197株融合子中，

5、篩選獲得融合株SAP3，ε-PL產(chǎn)量為5.167g/L，較兩出發(fā)菌株中較高產(chǎn)量菌株SAS17提高了18％。
　　通過研究碳源、氮源、金屬離子、pH值以及稀土元素等因素對(duì)SAP3菌株發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的影響，最終獲得SAP3菌株發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的合適培養(yǎng)配方:葡萄糖5％，酵母粉1％,(NH4)2SO41％, KH2PO40.136％, K2HPO40.08％, ZnSO4·7H2O0.04％,FeSO4·7H2O0.003％，硝酸鈧5

6、0μM，L-賴氨酸5mM，緩沖液pH4.0。菌株SAP3在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)后ε-PL產(chǎn)量可達(dá)到7.454g/L。
　　本研究通過60Coγ-射線照射和原生質(zhì)體融合育種方法，選育出遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)ε-PL變異株SAP3，在合適的培養(yǎng)條件下，ε-PL產(chǎn)量較原始菌株SAC23提高了394％，表明60Co照射和原生質(zhì)體融合育種方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)分離篩選的不吸水性鏈霉菌進(jìn)行育種提高ε-PL產(chǎn)量有效。所選育出遺傳性能穩(wěn)定的高變異株SA