實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)乙型肝炎病毒YMDD變異和乙型肝炎病毒基因型方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)是近年來興起的、已經(jīng)成為分子生物學(xué)重要技術(shù)之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。借助熒光信號(hào)來檢測(cè)PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面可以在每次PCR循環(huán)收集數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定域值循環(huán)數(shù)(CT值)，計(jì)算起始拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定

2、量。由于PCR的擴(kuò)增和產(chǎn)物分析過程都在一封閉的管中進(jìn)行，較之傳統(tǒng)的PCR方法大大減少了污染的幾率，因此熒光定量PCR具有特異、快速、敏感、準(zhǔn)確、線性范圍寬，操作簡(jiǎn)便安全，且無PCR后處理。該方法又根據(jù)熒光標(biāo)記的不同，分為熒光染料法和熒光探針法。熒光探針法又根據(jù)探針設(shè)計(jì)的不同原理分為5'核酸酶探針(5'Nuclease(TaqMan)Probes)，分子信標(biāo)(molecular beacon)和FRET雜交探針(FRET hybridiz

3、ationprobe)。TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是本課題的主要研究對(duì)象，本論文報(bào)道應(yīng)用選擇引物的原理建立TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法用于LAM治療HBV過程中的YMDD變異的點(diǎn)突變監(jiān)測(cè)以及TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法用于乙型病毒基因型的檢測(cè)。 第一部分選擇引物的TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于LAM療HBV過程中的YMDD變異的點(diǎn)突變監(jiān)測(cè)方法建立拉米夫定(Lamivudine，LAM)

4、是目前公認(rèn)的最有效而安全的抗病毒的核苷類似藥物，但長(zhǎng)期使用可誘發(fā)HBV病毒變異，引起病毒耐藥。酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)功能區(qū)變異是HBV拉米夫定耐藥的主要原因。 近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用許多方法進(jìn)行YMDD變異，如測(cè)序、線性探針分析[6]、基因芯片[7]、PCR-肽核酸[8]、聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性[9]，和通用模板PCR[10]等方法。鑒于我國(guó)醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室開展實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)十分普遍，這些實(shí)驗(yàn)

5、室都擁有熒光定量PCR分析儀，故此本文針對(duì)該類儀器，采用選擇性引物和TaqMan探針技術(shù)，建立了一種新的適應(yīng)這類設(shè)備的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。我們用此方法檢測(cè)187例臨床乙肝患者血清標(biāo)本，觀察HBV的YMDD變異情況，同時(shí)用測(cè)序法作為金標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)驗(yàn)證。結(jié)果證明，此方法在臨床YMDD變異診斷中具有快速、靈敏和特異的特點(diǎn)。第二部分應(yīng)用TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法用于乙型肝炎病毒基因型的檢測(cè)應(yīng)用TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)

6、150例HBV樣本進(jìn)行HBVDNA定量檢測(cè)和分型檢測(cè)，然后對(duì)其中載毒量大于5000IU/ml的113例標(biāo)本和一例進(jìn)行測(cè)序分型檢測(cè)。對(duì)于通過PCR測(cè)序方式獲得的114例樣本的DNA序列，全部使用NCBI在線分型工具(www.ncbi.nlm.ni.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)進(jìn)行DNA序列的比對(duì)、分析.進(jìn)行HBV基因分型。驗(yàn)證了該方法能快速對(duì)乙型肝炎病毒B基因型、C基因型以及B、C混合基因型進(jìn)