丙型肝炎病毒抗體化學發(fā)光檢測方法的建立及臨床應用.pdf

1、背景與目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是引起輸血后病毒性非甲非乙型肝炎的主要病原,主要通過輸血、靜脈吸毒途徑傳播,也可通過密切接觸和母嬰傳播。目前全世界約有1.7億HCV感染者,預計我國感染者不低于4000萬人。受感染者中約有一半可發(fā)展為慢性肝炎,進而部分可發(fā)展為肝硬化和肝細胞性肝癌。目前,尚無有效的丙型肝炎預防疫苗及治療藥物,因此對HCV感染的早期診斷是有效控制丙型肝炎病毒傳播的重要手段。目前,HCV感

2、染的實驗室診斷技術主要有血清HCV RNA、抗HCV抗體及HCV抗原檢測。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)檢測HCV RNA是目前HCV感染診斷最靈敏、最特異的方法,但其操作比較復雜,易造成污染,且價格昂貴,不適于大規(guī)模的篩查。HCV感染患者血清中的抗原水平很低,常規(guī)的免疫學、病毒學方法難以獲得陽性結(jié)果;因此,血清HCV抗原檢測尚不能作為一種實驗室的常規(guī)檢測手段?？笻CV檢測是HCV感染的主要證

3、據(jù)之一。目前,臨床應用最多的方法仍是以檢測血清抗HCV為主,而普遍采用的酶免疫的檢測方法,對于低水平人群容易造成漏檢;在國外化學發(fā)光法因其靈敏度高,已經(jīng)成為主要的檢測方法,而國內(nèi)在化學發(fā)光法檢測抗HCV上基本還屬于空白。因此,用化學發(fā)光法檢測抗HCV對進一步提高抗HCV檢測水平有重要意義。本文采用化學發(fā)光酶免疫分析(Chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA)的原理檢測人血清中的抗HCV抗體。<

4、br>　　方法:1、采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶標記到抗人IgG上,并配制成酶標抗體工作液:用pH9.6的碳酸鹽緩沖液將丙型肝炎病毒融合抗原(含CORE、NS3、NS4、NS5)包被于化學發(fā)光微孔板上,并優(yōu)化其最佳工藝;建立抗HCV化學發(fā)光酶免疫分析檢測體系,確定加樣模式、洗滌方式、反應溫度、反應時間、測定時間。2、通過檢測國家和國際標準品,評價該方法的靈敏度、特異性等性能指標;觀察常見的抗凝劑、特殊人群血清等對本方法測定性能的影

5、響;并和進口ELISA試劑盒進行臨床對照。
　　結(jié)果:1、確立了化學發(fā)光包被板的包被方法:采用國產(chǎn)微孔板;包被液和包被方式為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6),100μl/孔,4℃過夜,抗原包被濃度為1μg/ml;封閉液為0.01 mol/L PBS(pH7.4,含1％BSA和5％蔗糖),封閉方式為4℃過夜。建立了抗HCV化學發(fā)光檢測體系:100μl樣本稀釋液加10μl樣本,37℃反應30min,沈板6次,加1:400

6、0稀釋的酶標抗體100μl/孔,37℃反應30min,洗板6次,加入發(fā)光底物A、B各25μl,在10~15min內(nèi)檢測發(fā)光值。2、本方法的分析靈敏度為0.1NCU/ml。抗HBs陽性、抗核抗體陽性、多發(fā)性骨髓瘤患者、孕婦及嬰幼兒、抗HIV陽性血清對本方法無干擾;含膽紅素、膽固醇、甘油三酯血清標本在一定范圍內(nèi)不會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響;常用的抗凝劑不會對檢測造成干擾。本方法在檢測中國藥品生物制品檢定所的HCV抗體國家參考品時,陽性檢出率優(yōu)于國