丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測方法的研究.pdf

1、目的:建立抗原抗體聯(lián)合檢測酶聯(lián)免疫方法(ELISA)檢測外周血中的HCV核心抗原或抗體,確定適合HCV抗原抗體聯(lián)合檢測方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的陽性判斷值(Cutoff).并對該檢測方法的敏感度、特異性、穩(wěn)定性等方面進行研究。
　　方法:采用互不反應(yīng)的HCV抗核心抗原特異性單克隆抗體和重組抗原固相包被,辣根過氧化物酶標記另一株特異性單克隆抗體和鼠抗人IgG,采用雙抗體夾心法檢測血樣中的HCV核心抗原,間接法檢測血樣中的H

2、CV抗體。摸索樣本稀釋液的最佳成分及濃度,通過統(tǒng)計2000例無償獻血員的HCV抗原抗體聯(lián)合檢測ELISA測定吸光度(A)值確定本實驗室的Cutoff值,同時使用聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)方法進一步檢測0.17≤A值≤0.240(S/CO值為0.5~1.0)的標本共45份確定該Cutoff值的實際意義。
　　相同實驗條件下,經(jīng)過多次比較試驗確定HCV抗核心抗原特異性單克隆抗體及重組抗原的包被緩沖液的種類、包被濃度和包被體積;確定樣本稀釋

3、液的最佳成分及濃度;確定酶標抗體的工作濃度;自配樣本稀釋液和購買樣本稀釋液在光密度(OD)等方面進行比較;反應(yīng)體系初步建立后,檢測體系的敏感度、特異性、穩(wěn)定性、線性范圍及變異系數(shù)等指標;采用HCV抗原檢測法、HCV抗體檢測法、PCR和HCV Ag-Ab combination四種方法同時檢測1000例臨床標本,對其敏感性與特異性進行比較。
　　結(jié)果:在相同實驗條件下,經(jīng)過多次比較實驗確定HCV抗核心抗原特異性單克隆抗體包被緩沖液為

4、 PH4.6的醋酸鹽緩沖液,包被濃度為5ug/mL,包被體積為100 ug/well;HCV重組抗原包被緩沖液為PH9.2的碳酸鹽緩沖液,包被濃度為5ug/mL,包被體積為100 ug/well;樣本稀釋液為抗體稀釋液、1％尿素、0.5%trion100酶標記單克隆抗體的工作濃度為1:1000;酶標記鼠抗人IgG抗體的工作濃度為1:15000;使用本研究調(diào)試的試劑,通過對檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理確定 Cutoff值為0.212,對0.17≤

5、A值≤0.240的45份標本進行PCR檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩份為陽性,其中1份A值為0.222,另外1份A值為0.235。該體系的敏感度為0.4ng/mL,線性范圍為0-20 ng/mL,批內(nèi)變異系數(shù)〈10%,批內(nèi)變異系數(shù)〈10%;和抗體檢測法同時測定1000例臨床樣本,抗體檢測法檢出25例陽性,聯(lián)合檢測法檢出33例陽性,這33例陽性標本中23例為抗體檢測陽性;用PCR方法檢測抗體檢測法陽性標本,結(jié)果與聯(lián)合檢測法一致23例陽性,2例陰性;用P