煙曲霉誘導(dǎo)宿主細(xì)胞吞噬過程中磷脂酶D的激活及其功能研究.pdf

1、目的：本研究探討煙曲霉分生孢子在侵染人肺Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549)過程中宿主細(xì)胞內(nèi)重要的信號效應(yīng)蛋白磷脂酶D(PLD)活性變化及其對煙曲霉侵染率的影響,并初步分析該內(nèi)化吞噬的過程中煙曲霉分生孢子、肌動(dòng)蛋白骨架以及PLD活性的相互關(guān)系。
　　 方法：以煙曲霉分生孢子刺激人肺Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549)作為模型,分別采用脂化學(xué)法及Triton破膜法測定不同感染比(MOI,真菌孢子/細(xì)胞)和不同感染時(shí)間下,細(xì)胞內(nèi)PLD活性以及煙曲霉分生孢子

2、侵染率的變化；采用脂化學(xué)法分別測定煙曲霉活菌和熱滅活菌的休眠孢子、膨脹孢子、出芽孢子刺激A549細(xì)胞后引起的細(xì)胞內(nèi)PLD活性變化；利用免疫熒光標(biāo)記以及激光共聚焦顯微鏡等技術(shù),觀察煙曲霉分生孢子在侵染A549細(xì)胞過程中與細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架和PLD蛋白的關(guān)系；用不同濃度的PLD蛋白化學(xué)抑制劑(1-丁醇)預(yù)處理細(xì)胞,測定其對煙曲霉分生孢子侵染率的影響；分別通過短暫轉(zhuǎn)染技術(shù)和RNA干涉技術(shù)造成細(xì)胞內(nèi)PLD基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)來研究其對煙曲霉分生孢

3、子侵染率的影響。
　　 結(jié)果：煙曲霉分生孢子對A549細(xì)胞的侵染率隨感染比(MOI)和感染時(shí)間的增加而顯著增加,同時(shí)均伴有細(xì)胞內(nèi)PLD的顯著激活(p<0.05)；煙曲霉活菌的休眠孢子、膨脹孢子和出芽孢子均可以激活細(xì)胞內(nèi)PLD(p<0.05),其中膨脹孢子的激活作用最為明顯。分生孢子經(jīng)熱滅活后激活細(xì)胞內(nèi)PLD作用不如活菌明顯；煙曲霉分生孢子刺激.A549細(xì)胞后肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生劇烈重排,并在煙曲霉分生孢子周圍形成了吞噬泡,同時(shí)細(xì)胞被

4、孢子刺激后其PLD蛋白移位至吞噬泡周圍與孢子產(chǎn)生明顯的共定位；用一定濃度(0.4％)的PLD化學(xué)抑制劑1-丁醇預(yù)處理A549細(xì)胞可顯著降低煙曲霉分生孢子對細(xì)胞的侵染率(p<0.05)；細(xì)胞內(nèi)PLD基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)后煙曲霉侵染率均有明顯下降(p<0.05)。
　　 結(jié)論：煙曲霉分生孢子侵染A549細(xì)胞過程中伴有PLD的激活和細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的重排,二者與煙曲霉分生孢子在空間上的定位密切相關(guān)；細(xì)胞內(nèi)PLD活性變化對于煙曲霉內(nèi)化侵入