磷脂酶D制備及其催化合成磷脂酰絲氨酸研究.pdf

1、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)的攝入可以降低腦部功能障礙、預(yù)防老年癡呆、治療腦萎縮、減緩小兒多動癥，但天然存在的PS很少，所以，制備PS尤顯重要。生物酶法合成PS具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點?；诖?，本論文系統(tǒng)研究了菌株DZQ2a發(fā)酵制備磷脂酶D(phospholipase，PLD)，并探討了酶促卵磷脂與L-絲氨酸轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)合成PS的催化性能。
　　 首先篩選出可以穩(wěn)定生產(chǎn)PLD的高

2、產(chǎn)菌株——DZQ2a，經(jīng)過對富油土壤樣本的初篩和復(fù)篩，獲得的該菌株具有的PLD生產(chǎn)遺傳穩(wěn)定性良好，產(chǎn)酶活5.36U/mL。通過對菌株的形態(tài)學特性、遺傳學特性及生理生化特性考察，確定該菌株為Ochrobactrumsp.，其同源性與OchrobactrumintermediumT13可信度高達99％，且生理生化特性完全一致。
　　 系統(tǒng)研究了DZQ2a制備PLD的條件及PLD的酶學特性。用正交法優(yōu)化該發(fā)酵過程得到的最優(yōu)制備條件下，

3、PLD的酶活可達7.35U/mL，各發(fā)酵條件對PLD的影響大小依次為:pH＞接種量＞溫度＞發(fā)酵時間，其中pH、接種量、溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶呈顯著影響，發(fā)酵時間呈不顯著影響。繼而使用微濾、鹽析、透析、凝膠過濾等方法對發(fā)酵液中PLD進行分離純化，通過對純化過程中條件的優(yōu)化，獲得單位酶活為83.51U/mg，回收率為12.53％。純化后的PLD經(jīng)SDS-PAGE檢測，其分子量約為37kDa，并在4℃，pH7.0條件下具有良好的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性，

4、在40℃、pH7.0條件下PLD活力最高，Na+對PLD酶活具有促進作用。
　　 深入研究了在新型溶劑體系（2-甲基四氫呋喃/γ-戊內(nèi)酯）中，由菌株DZQ2a產(chǎn)的PLD催化制備PS的工藝。酶催化主要受到均相介質(zhì)組成、底物摩爾比、L-絲氨酸用量、酶用量及反應(yīng)溫度的影響，優(yōu)化后的催化條件為:2-甲基四氫呋喃/γ戊內(nèi)酯體積比1∶2，L-絲氨酸濃度0.4mmol/L，L-絲氨酸與磷脂酰膽堿比例1∶3，PLD酶活106.0U，反應(yīng)溫度40