磷脂酶C gamma1在斑馬魚ICM區(qū)粒細(xì)胞成熟過程中的作用.pdf

1、脊椎動(dòng)物的造血分為原始造血和定向造血，而定向造血干細(xì)胞則是動(dòng)物體成體所有血細(xì)胞的來源。斑馬魚作為一種新興的模式生物在研究造血方面有很大的優(yōu)勢，斑馬魚與哺乳動(dòng)物的造血在解剖位置上是一一對(duì)應(yīng)的，在分子調(diào)控機(jī)制上是高度保守的。斑馬魚的定向造血起源于背主動(dòng)脈-中腎-性腺區(qū)(AGM)，逐步遷移到尾部造血組織(CHT)，最終遷移到斑馬魚的成體造血器官腎臟。為了研究斑馬魚定向造血干細(xì)胞起源，自我更新，遷移過程中的分子機(jī)制，我們應(yīng)用ENU化學(xué)誘變技術(shù)獲

2、得斑馬魚隱性突變家系，以全胚胎原位雜交技術(shù)為篩選手段進(jìn)行了一次大規(guī)模的前向遺傳學(xué)篩選，對(duì)受精后36小時(shí)和5天的斑馬魚胚胎分別以runx1和c-myb為探針，篩選影響定向造血干細(xì)胞發(fā)育、自我更新以及遷移的突變株。最終經(jīng)過篩選以及互補(bǔ)分析，我們?cè)谝詒unx1為探針的篩選中在200個(gè)家系中篩到了5個(gè)突變;在以c-myb為探針的篩選中在667個(gè)家系中得到了86個(gè)突變。在這些突變中有個(gè)別突變株有粒細(xì)胞發(fā)育異常的特征，部分突變株已經(jīng)做了定位克隆并且

3、找到了突變基因。
　　其中粒細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的一部分，負(fù)責(zé)機(jī)體對(duì)組織損害細(xì)菌感染的抵抗。成熟的粒細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的作用最明顯。粒細(xì)胞的成熟是粒細(xì)胞中的顆粒成熟發(fā)育的一個(gè)過程，包括6個(gè)不同的階段，分別是原粒細(xì)胞，早幼粒細(xì)胞，中幼粒細(xì)胞，晚幼粒細(xì)胞，帶狀細(xì)胞，分葉細(xì)胞。如果這個(gè)過程被阻滯，將會(huì)導(dǎo)致一種疾病叫做先天性的粒細(xì)胞減少癥。先天性粒細(xì)胞減少癥是一種隱形遺傳疾病，主要的特征是循環(huán)中的中性粒細(xì)胞減少，粒細(xì)胞的成熟被阻滯在早幼粒細(xì)胞階段。

4、
　　在我們的前向遺傳學(xué)篩選中，我們得到了一個(gè)突變株LDD239，它有可能是一個(gè)先天性粒細(xì)胞減少癥的模型。首先發(fā)現(xiàn)這個(gè)突變?cè)诎l(fā)育的早期在ICM區(qū)粒細(xì)胞的特異基因mpo的表達(dá)有明顯減少，而mpo在前部側(cè)板中胚層的表達(dá)并沒有受到影響。同時(shí)突變胚胎也表現(xiàn)出異常的血管發(fā)育。而其它的各系血細(xì)胞的發(fā)育并沒有受到影響。通過定位克隆的方法，我們找到了突變基因磷脂酶Cgamma-1，在突變胚胎中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)點(diǎn)突變從T變成了A。通過mRNArescue

5、和MOknockdown的技術(shù)我們確定確實(shí)是磷脂酶C的突變?cè)斐闪吮硇?。我們的?shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)磷脂酶Cgamma-1的突變株中的兩個(gè)表型是相互獨(dú)立的。所以plcg1特異地影響粒細(xì)胞生成的過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示plcg1并沒有影響粒細(xì)胞的起源而是特異地影響了粒細(xì)胞的成熟階段。
　　在哺乳動(dòng)物中GCSF-GCSFR-JAK2信號(hào)通路參與到粒細(xì)胞發(fā)育過程中。首先我們的實(shí)驗(yàn)排除了gcsf/gcsfr與LDD239突變表型的相關(guān)性。在jak2aMO注