黃瓜磷脂酶Dα基因的克隆及其正反義表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、磷脂酶D(PLD)是植物組織中普遍存在的一種酶。PLD及其產(chǎn)物PA在信號傳導(dǎo)、膜脂降解中起重要作用,與植物脅迫密切相關(guān)。黃瓜作為主要的蔬菜,在種植過程中經(jīng)常遇到鹽害、干旱等逆境脅迫。本試驗(yàn)以‘新泰密刺’黃瓜為試材,用RT-PCR結(jié)合RACE法從黃瓜幼葉中克隆了PLD基因的全長序列,并構(gòu)建其正反義表達(dá)載體,分別用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和子房注射法進(jìn)行了煙草和黃瓜的轉(zhuǎn)基因研究,并利用RealTime-PCR法對NO3-脅迫下黃瓜PLD基因的表達(dá)進(jìn)行了

2、定量分析。主要結(jié)果如下: 1.利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)獲得了黃瓜磷脂酶D基因,命名為cuPLDα,GenBank注冊號為EF363796。 2.序列分析表明,cuPLDα cDNA全長2,756 bp,編碼區(qū)2,427 bp,編碼808個氨基酸,預(yù)測蛋白質(zhì)分子量約為91.8 kD,等電點(diǎn)為5.37。黃瓜磷脂酶Dα存在C2結(jié)構(gòu)域、IYIENQFF結(jié)構(gòu)域和HKD結(jié)構(gòu)域。黃瓜磷脂酶Dα屬于磷脂酶Dα家族,不存在有意義跨

3、膜螺旋結(jié)構(gòu)。 3.提出一個新的解決基因克隆中基因突變的方法:通過拼接兩個或以上陽性克隆的非突變區(qū)域,構(gòu)建無突變?nèi)LcDNA。 4.利用RealTime-PCR法分析發(fā)現(xiàn),經(jīng)不同濃度NO3-處理0.5 h后,cuPLDα表達(dá)隨NO3-濃度增加而增強(qiáng)。182 mmol/L的NO3-處理cuPLDα表達(dá)最強(qiáng),為對照的4.66倍。 5.為研究黃瓜磷脂酶Dα的功能,構(gòu)建其正義表達(dá)載體pBI121-cuPLD和反義表達(dá)載體p

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