DNMT1誘導(dǎo)SOCS1高甲基化在巨噬細(xì)胞活化中的作用及其部分機(jī)制研究.pdf

1、在關(guān)節(jié)炎、肝纖維化等炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,巨噬細(xì)胞活化分泌炎癥因子是其發(fā)病的主要特征,而抑制巨噬細(xì)胞的活化是抗炎免疫治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。作為細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制分子—SOCS1,在組織損傷和炎癥性疾病的抑制中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在各種類型的腫瘤中,SOCS1的失活都與啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化有關(guān)。為了更進(jìn)一步研究DNA甲基化在巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子中的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)離體觀察SOCS1基因在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的變化,及其對(duì)巨噬細(xì)胞分泌炎癥

2、因子的作用,研究其部分作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容主要含有以下四個(gè)部分:
　　1.SOCS1在LPS誘導(dǎo)RAW264.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及甲基化的狀態(tài)。
　　選用RAW264.7(小鼠巨噬細(xì)胞株)為研究對(duì)象,利用LPS1μg/ml誘導(dǎo)24 h誘導(dǎo)其活化,RT-PCR方法檢測(cè)SOCS1,TNF-α,IL-6的mRNA表達(dá)變化;免疫印跡觀察SOCS1蛋白的表達(dá)變化;Elisa方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α,IL-6

3、的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的過(guò)程中SOCS1的表達(dá)降低。利用甲基化特異性PCR(MSP-PCR)檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞活化過(guò)程中SOCS1甲基化的狀態(tài),我們發(fā)現(xiàn)SOCS1基因發(fā)生了高甲基化。
　　2.SOCS1在DNA甲基化抑制劑作用下發(fā)生了去甲基化及自身表達(dá)的恢復(fù),進(jìn)而抑制了RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌。
　　以RAW264.7為研究對(duì)象,利用LPS1μg/ml誘導(dǎo)活化2

4、4h和5-azadC2μmol/l溫育48h后,RT-PCR方法檢測(cè)SOCS1,TNF-α,IL-6的mRNA表達(dá)變化;免疫印跡觀察SOCS1蛋白的表達(dá);Elisa方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α,IL-6的表達(dá)變化。利用甲基化特異性 PCR(MSP-PCR)檢測(cè) LPS和5-azadC作用的RAW264.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中 SOCS1基因甲基化的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),5-azadC能使SOCS1去甲基化進(jìn)而恢復(fù)SOCS1的表達(dá)

5、,并抑制炎癥因子TNF-α,IL-6的分泌。
　　3.DNMT1調(diào)控SOCS1的表達(dá)及其對(duì)甲基化的作用研究。
　　根據(jù)DNMT1的堿基序列設(shè)計(jì)并合成小干擾 RNA(small interfering RNA,siRNA),通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞內(nèi),熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。RT-PCR檢測(cè) SOCS1,TNF-α,IL-6 mRNA的表達(dá);Western Blot檢

6、測(cè)DNMT1、SOCS1蛋白的表達(dá);Elisa方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α,IL-6的表達(dá)變化。MSP-PCR檢測(cè)沉默DNMT1基因后SOCS1甲基化的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),沉默的DNMT1可以促進(jìn) SOCS1的去甲基化及SOCS1的表達(dá),進(jìn)而抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中炎癥因子TNF-α,IL-6的分泌即DNMT1通過(guò)介導(dǎo)SOCS1甲基化來(lái)抑制炎癥因子的分泌。
　　4.DNA甲基化抑制劑及DNMT1沉默對(duì)SOCS