抑癌基因甲基化在食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)差異及其與DNMT1的關(guān)系.pdf

1、目的：應(yīng)用靶向 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）基因的短發(fā)夾 RNA（shRNA）重組質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的食管鱗癌細(xì)胞，并建立裸鼠的動物移植瘤模型，研究其對食管鱗癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的影響。
　　方法：1.實驗組予以 shRNA-DNMT1序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對照組僅予以shRNA-NC陰性對照序列，構(gòu)建沉默 DNMT1基因的重組慢病毒并感染食管鱗癌細(xì)胞后獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，建立裸鼠的動物移植瘤模型。2.cell counting kit

2、8（CCK-8）檢測細(xì)胞增殖生長能力。3.集落形成實驗檢測細(xì)胞形成集落的能力。4.Transwell實驗檢測腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。5.流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡與周期。6.實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測食管鱗癌細(xì)胞和裸鼠移植瘤組織中抑癌基因P16、CDH13、RASSF1A、APC、MGMT、ASC、DAPK和DNMT1的mRNA表達(dá)。7.甲基化特異性PCR（Methylation specific PCR，

3、 MSP）檢測食管鱗癌細(xì)胞和裸鼠移植瘤組織中抑癌基因 RASSF1A和DAPK的甲基化狀態(tài)。8.Western blot檢測食管鱗癌細(xì)胞和裸鼠移植瘤組織中抑癌基因RASSF1A和DAPK所調(diào)控的蛋白和DNMT1蛋白的表達(dá)。9.免疫組化檢測裸鼠移植瘤組織中RASSF1A和DAPK蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.成功構(gòu)建沉默DNMT1基因的重組慢病毒并感染食管鱗癌細(xì)胞，獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。2.與對照組比較，qRT-PCR結(jié)果表明食管鱗癌細(xì)胞和

4、裸鼠移植瘤中實驗組DNMT1的 mRNA表達(dá)明顯減少，而RASSF1A和DAPK的mRNA表達(dá)明顯增多（P＜0.01）。3.Western blot表明食管鱗癌細(xì)胞和裸鼠移植瘤中實驗組 DNMT1蛋白水平明顯降低，而RASSF1A和DAPK所表達(dá)的蛋白水平明顯增多（P＜0.05）。4.CCK檢測表明實驗組中細(xì)胞增殖速度明顯減慢（P＜0.05）。5.集落形成實驗表明實驗組中細(xì)胞的集落數(shù)明顯減少（P＜0.01）。6.Transwell實驗表

5、明實驗組中食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯減弱（P＜0.01）。7.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：與對照組相比實驗組食管癌細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比增高（P＜0.01），集中在早調(diào)階段；與對照組相比，實驗組食管癌細(xì)胞呈現(xiàn)以下改變：DNA合成前期（G0/G1期）細(xì)胞的百分比增高（P<0.001），DNA合成期（S期）細(xì)胞的百分比減少（P<0.001）， DNA合成后期（G2/M期）細(xì)胞的百分比減少（P<0.001）。8.免疫組化表明裸鼠移植瘤中實驗組