應(yīng)用RNA干涉抑制肺癌細胞高表達的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）的研究.pdf

1、本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)敲降腫瘤細胞中異常高表達的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)，并觀察腫瘤細胞惡性表型的變化，以期探討DNMT1與抑癌基因異常甲基化等腫瘤惡性表型之間的關(guān)系，以及DNMT1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，進而討論以DNMT1作為RNAi治療腫瘤靶標(biāo)的應(yīng)用前景。 首先采用MSP、COBRA等DNA甲基化檢測技術(shù)，RT-PCR、Real-timePCR和Westernblot等基因表達檢測技術(shù)篩選獲得DNMT1高表達而抑癌

2、基因RASSF1A異常甲基化失活的細胞系NCI-H157(非小細胞肺腺癌)。以該細胞系作為RNAi敲降DNMT1的體外細胞模型，應(yīng)用RT-PCR、熒光定量PCR等技術(shù)，篩選獲得兩個有效的RNAi靶位，分別為SD1和SD5。SD1敲降DNMT1的表達后，RAFF1A表達得以恢復(fù)，同時，NCI-H157的增殖受到抑制。流式分析結(jié)果顯示，SD1能夠誘導(dǎo)NCI-H157G1期阻滯。為獲得穩(wěn)定敲降DNMT1的細胞系，本研究著手建立了四環(huán)素誘導(dǎo)型s

3、hRNA表達系統(tǒng)，通過共轉(zhuǎn)染報告基因Luciferases表達載體篩選獲得了高表達四環(huán)素抑制子TR的pcDNA6TR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，并構(gòu)建了分別表達SD1和SD5的重組表達載體pTER+-shRNA(SD1)和pTER+-shRNA(SD5)。 上述結(jié)果表明，腫瘤細胞中DNMT1的高表達是導(dǎo)致抑癌基因異常甲基化的重要原因，敲降DNMT1表達，能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型。探討和闡明DNMT1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用不僅是重要的基

4、礎(chǔ)研究課題，對于臨床治療也具有重要意義。 本研究檢測了NCI-H157細胞中抑癌基因RASSF1A、p16基因調(diào)控區(qū)CpG島的甲基化情況，以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的表達，結(jié)果顯示p16啟動子區(qū)CpG島并未甲基化，而且有表達，這與文獻報道不符，可能原因是細胞系在傳代過程中發(fā)生了變異。本研究首次以非小細胞肺腺癌細胞NCI-H157為細胞模型，應(yīng)用RNAi敲降高表達的DNMT1，并證明隨著DNMT1表達下調(diào)，RAFF1A恢