MicroRNA-126對大鼠胰島β細(xì)胞胰島素信號通路的調(diào)控作用及機制.pdf

1、第一部分大鼠胰島β細(xì)胞分離及純化
　　目的：優(yōu)化 SD大鼠胰島β細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng)的方法與條件，為研究microRNA-126(miR-126)在2型糖尿病發(fā)病中的作用與機制提供活性與功能良好的胰島β細(xì)胞。
　　方法：SD大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)膽總管逆行灌注采用8mL膠原酶Ⅴ（1mg/mL含DNase I100U）、原位消化后Hitopaque-1077梯度離心分離純化胰島細(xì)胞并作培養(yǎng)，再將培養(yǎng)后的胰島細(xì)胞用胰蛋白

2、酶消化使其分散成單個的β細(xì)胞后對其進行培養(yǎng)。
　　結(jié)果：每只大鼠用上述方法可分離、純化得到胰島細(xì)胞372±45個，胰島細(xì)胞純度大于90％，胰島細(xì)胞存活率大于95%。
　　結(jié)論：膽總管逆行灌注膠原酶Ⅴ（含DNase I100U）原位消化分離胰島細(xì)胞，可有效避免胰腺膠狀物質(zhì)的產(chǎn)生，提高胰島細(xì)胞的收獲量與實驗成功率；Hitopque-1077梯度離心純化胰島細(xì)胞的方法具有操作簡單、便捷、經(jīng)濟等優(yōu)點，純化得到的胰島細(xì)胞純度與存活率高

3、，功能活性強；使用改良后DMEM高糖培養(yǎng)液（15%FBS，50μmol/Lβ-巰基乙醇，10 mmol/L HEPES）培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞形態(tài)完整，活力強，適宜用于胰島β細(xì)胞培養(yǎng)。
　　第二部分 MicroRNA-126對大鼠胰島β細(xì)胞胰島素信號通路的調(diào)控作用及機制
　　研究背景：隨著人類生活方式與生存環(huán)境的改變，糖尿病患者逐年增多，臨床90%以上的糖尿病患者為2型糖尿病，胰島素抵抗是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，

4、miR-126對胰島素信號通路有一定調(diào)控作用，miR-126與胰島素抵抗存在一定的聯(lián)系。為了進一步探究miR-126在胰島素信號通路中的調(diào)控作用及其對胰島β細(xì)胞凋亡的影響，我們建立了一個可靠的原代培養(yǎng)的大鼠胰島β細(xì)胞模型。
　　目的：本研究旨在探討miR-126在原代分離培養(yǎng)的正常SD大鼠胰島β細(xì)胞胰島素信號通路中的調(diào)控作用及其對胰島β細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：以原代分離培養(yǎng)的正常SD大鼠胰島β細(xì)胞為模型，轉(zhuǎn)染合成的miR

5、-126模擬物（miR-126 mimic）或miR-126抑制劑（miR-126 inhibitor），干預(yù)miR-126的表達，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)染后的大鼠胰島β細(xì)胞用胰島素（100nm）刺激12小時，提取細(xì)胞的總 RNA，用熒光定量 PCR技術(shù)以U6及β-actin為內(nèi)參基因檢測miR-126、IRS-1、IRS-2的相對表達量；提取細(xì)胞總蛋白進行BCA蛋白測定，用western Blot技術(shù)檢測IRS-1

6、/2，Akt，PIK3R2蛋白表達量。
　　結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示：miR-126 mimics、miR-126 inhibitor、negative control轉(zhuǎn)染效率較高； miR-126 mimic組大鼠胰島β細(xì)胞凋亡數(shù)顯著高于NC組和miR-126 inhibitor組（P<0.05）；熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示：miR-126 mimic組大鼠胰島β細(xì)胞 IRS-1/2相對表達量較NC組和miR-126 inhib