Wnt信號通路對NIT-1胰島β細胞的作用及機制.pdf

1、第一部分 Wnt3a對小鼠NIT-1胰島β細胞的作用
　　 【目的】通過體外培養(yǎng)小鼠胰島細胞瘤細胞NIT-1細胞，觀察Wnt3a對NIT-1細胞的增殖、凋亡及胰島素分泌功能的影響。
　　 【方法】體外培養(yǎng)小鼠NIT-1胰島β細胞，用高糖(33.3 mmol/L)刺激NIT-1細胞96小時，或細胞因子混合物（IL-1β10ng/ml+TNF-α50ng/ml+IFN-γ 50ng/ml）刺激NIT-1細胞18小時，誘導NI

2、T細胞凋亡增加；同時以純化重組的Wnt3a（100ng/ml）蛋白孵育正常及高糖或細胞因子介導損傷的NIT-1細胞24小時，誘導激活Wnt信號通路。BrdU方法檢測細胞增殖，Tunnel及PI-Annexin Ⅴ（Annexin-Ⅴ-FITC/PI）雙染流式凋亡檢測，放免法檢測細胞胰島素分泌。
　　 【結果】高糖刺激后誘導細胞凋亡率增加為正常對照組1.7倍，細胞因子刺激后可誘導細胞凋亡率增加為正常對照組1.9倍，差異有顯著性，P

3、<0.001；給予Wnt3a蛋白干預后，正常組細胞增殖率增加58％，高糖組細胞增殖率增加51％，細胞因子組細胞增殖率增加75％，與對照組相比，差異有顯著性，P<0.001；Wnt3a蛋白干預后，正常組細胞凋亡率減少32％，高糖組凋亡率較少35％，細胞因子組凋亡率較少45％，差異有顯著性，P<0.001；胰島素分泌功能較對照組改善，P<0.05。
　　 【結論】Wnt3a能夠促進NIT-1胰島β細胞的增殖，減少其凋亡，改善細胞的胰

4、島素分泌功能。
　　 第二部分Wnt/β-catenin/TCF信號通路對NIT-1保護作用的初步探討
　　 【目的】探討Wnt信號通路對胰島β細胞存活及功能的保護作用的分子生物學機制。
　　 【方法】體外培養(yǎng)小鼠NIT-1胰島β細胞，以重組純化Wnt3a蛋白激活Wnt信號通路，real-time PCR分析LRP-5，GSK3β，β-catenin，TCF7L2等Wnt信號通路中關鍵因子的改變，檢測細胞存活促進

5、因子Bcl-2,和細胞周期調(diào)節(jié)因子Pitx2，CyclinD2，胰島素分泌相關基因PDX-1，GLUT2，Glucokinase（GK）的表達。并探討與胰島β細胞生長和功能密切相關基因，IRS-2和IRS-1的表達狀況。Western Blotting檢測β-catenin，IRS-1，IRS-2的蛋白水平。并且所有組均給予Wnt通路阻斷劑Dkk1（160ng/ml）干預對比，觀察Wnt3a對β細胞的促進作用對Dkk1的敏感性。

6、　　 【結果】Wnt3a蛋白干預后，NIT-1細胞的TCF7L2 mRNA水平上調(diào)為對照組4-5倍，β-catenin游離蛋白水平為對照組1.5倍。與細胞增殖相關基因Pitx2、CyclinD2 mRNA表達增加為對照組4-5倍和1.6倍，細胞存活促進因子Bcl-2表達增加為對照組1.2倍，胰島素相關基因PDX-1，Glucokinase（GK）mRNA表達增加，Wnt3a蛋白干預組為正常對照組2倍和1.5倍；GLUT2 mRNA水平

7、Wnt3a蛋白組與對照組相比無明顯改變，IRS-2的mRNA及蛋白水平都顯著增加，分別為對照組10-11倍和2-3倍；IRS-1表達無明顯改變。Dkk1可以顯著抑制Wnt3a對NIT-1細胞的上述作用，P<0.05。
　　 【結論】Wnt3a通過激活Wnt/β-catenin/TCF經(jīng)典信號通路，使β-catenin游離增多，進入核內(nèi)，與TCF7L2結合，并激活TCF7L2轉錄活性，促進Wnt通路下游相關靶基因Pitx2、Cyc

8、lin D2、Bcl-2的表達促進細胞的增殖，保護細胞的凋亡，上調(diào)PDX-1和GK的表達，改善β胰島素分泌功能。而且，Wnt3a作用于NIT-1細胞后，使NIT-1細胞的IRS-2表達明顯上調(diào)。Dkk1可以顯著抑制Wnt3a對NIT-1細胞的上述作用。
　　 第三部分IRS-2/PI3K/AKT介導Wnt/β-catenin/TCF對NIT-1細胞作用的分子生物學機制
　　 【目的】研究胰島素信號通路IRS-2/PI3K

9、/AKT在Wnt3a對胰島β細胞作用中的地位，進一步探討Wnt信號通路對NIT-1胰島β細胞作用的生物學機制。
　　 【方法】Wnt3a激活NIT-1細胞的Wnt信號通路，流式檢測細胞增殖及凋亡，放免法檢測NIT-1細胞胰島素分泌功能（GSIS）。Real-time PCR及Western Blotting檢測IRS-2/PI3K/AKT信號通路中IRS-2、磷酸化AKT和GSK3β蛋白水平；并分別給予Wnt通路阻斷劑Dkk1（

10、160ng/ml）及PI3K阻斷劑wortmannin（100nmol/L），流式檢測相應的細胞增殖及凋亡變化；熒光定量PCR及Western Blotting檢測Wnt信號通路中β-catenin、TCF7L2表達量及IRS-2/PI3K通路中IRS-2、p-AKT、p-GSK3β的表達及磷酸化水平對阻斷劑Dkk1和wortmannin的敏感性。
　　 【結果】Wnt3a激活Wnt經(jīng)典信號通路后, IRS-2蛋白表達水平增加為

11、對照組2-3倍，p-AKT表達增加60％，相應，β細胞增殖率增加73％，凋亡率減少25％，胰島素分泌功能明顯改善，差異有顯著性，P<0.05；Dkk1可以阻斷外源性Wnt3a所引起的Wnt/beta-catenin/TCF及IRS-2/PI3K/AKT通路活性改變（與Wnt3a組相比，IRS-2表達下降47％，p-AKT表達下降30％），阻斷Wnt3a對NIT-1細胞的增殖與凋亡的正性調(diào)節(jié)（與Wnt3a組相比，凋亡率增加45％，增殖率下

12、降47％）；wortmannin可以明顯抑制IRS-2/PI3K/AKT通路中p-AKT水平的增加（減少37％，），不影響β-catenin與TCF7L2的表達，可顯著抑制Wnt3a對胰島β細胞的促進作用（與Wnt3a組相比，凋亡率增加34％，增殖率下降33％，差異有顯著性），而且，Dkk1對Wnt3a的抑制作用要比wortmannin顯著，差異有顯著性，P<0.05。Wnt3a可以改善NIT-1細胞在基礎（2.8 mM）和高糖（16.