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文檔簡介
1、p53基因是重要的腫瘤抑制基因,其編碼的p53蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面均具有關(guān)鍵性作用,人類50%以上的腫瘤組織中存在p53基因突變,是所檢測到的最常見的基因突變,有研究人員指出,野生型p53蛋白功能的缺失是腫瘤發(fā)生的必要條件。將p53蛋白導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞就可以發(fā)揮較好的的抗腫瘤功效,但是p53蛋白作為大分子物質(zhì)自身難以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,使其應(yīng)用受到了一定限制。
Kumar等研究發(fā)現(xiàn)來源于狂犬病毒衣
2、殼糖蛋白的衍生肽段RDP(rabies virusglycoprotein derived peptide)能攜帶抗病毒的siRNA通過血腦屏障特異性地傳遞到感染了腦炎的小鼠腦中,大大提高患腦炎小鼠的存活率,并且RDP作為載體具有較高的安全性。Kumar等對RDP的開創(chuàng)性研究為解決大分子難以穿過細(xì)胞膜及血腦屏障入腦的問題提供了很好的基礎(chǔ),我們實(shí)驗(yàn)室前期成功利用RDP攜帶大分子蛋白質(zhì)BDNF快速特異性進(jìn)入腦內(nèi)。以往研究中一般通過往細(xì)胞穿膜
3、肽(cell-penetrating peptides,CPP)攜帶大分子進(jìn)入細(xì)胞,RDP多肽作為新型腦靶向遞藥載體克服了CPP無組織特異性的缺陷。
本實(shí)驗(yàn)利用生物技術(shù)通過大腸桿菌表達(dá)RDP-p53融合蛋白,以期通過腦靶向遞藥載體RDP攜帶p53穿過血腦屏障,用于開發(fā)治療腦腫瘤比如神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新型藥物。生物技術(shù)藥物在體內(nèi)存在的最普遍的問題之一是免疫反應(yīng),它不僅降低藥物療效,而且損害機(jī)體,免疫原性的評價(jià)成為闡明這些藥物臨床安全性
4、和有效性的關(guān)鍵因素,評價(jià)非期望出現(xiàn)的免疫原性是生物技術(shù)藥物臨床前和臨床評價(jià)的重要內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA檢測血清IgG的水平來評價(jià)免疫原性的強(qiáng)弱。p53除具有抗腫瘤作用外,還與炎癥介質(zhì)之間存在一定聯(lián)系,p53可以影響炎癥細(xì)胞因子(inflammatory cytokine)的分泌;研究表明機(jī)體釋放的一系列炎癥細(xì)胞因子可以對藥物代謝酶的表達(dá)和功能產(chǎn)生調(diào)控,機(jī)體對藥物的處置過程會發(fā)生顯著改變。因此,炎癥細(xì)胞因子可能會影響RDP-p53融合
5、蛋白的藥理作用。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α的水平來分析腹腔注射不同劑量的RDP-p53融合蛋白對小鼠血清炎癥細(xì)胞因子水平的影響,為研究RDP-p53融合蛋白抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥理作用奠定基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行:第一部分:以質(zhì)粒pET28a-p53為模板擴(kuò)增p53基因,并克隆至原核表達(dá)載體pET28a-RDP中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-RDP-p53,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta,IPTG誘
6、導(dǎo)表達(dá)蛋白并純化,SDS-PAGE確定該蛋白準(zhǔn)確性。第二部分:將昆明小鼠分為空白對照組(等容生理鹽水)和RDP-p53融合蛋白高、中、低劑量(4 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg)組,經(jīng)腹腔注射免疫,每隔2d給藥1次,30 d后眼球取血,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中IgG和炎癥細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子α)的含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1雙酶切及測序結(jié)果顯示,p53基因已克隆入表達(dá)載體中;
7、RDP-p53融合蛋白在上清和沉淀中均獲得表達(dá)。2 ELISA測定結(jié)果表明:與對照組比較,低、中劑量組小鼠血清中IgG含量沒有明顯升高(P>0.05),高劑量組顯著升高(P<0.05);與對照組比較,低、中劑量組小鼠血清炎癥因子水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05),高劑量組的IL-1β和TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論:成功表達(dá)并純化RDP-p53融合蛋白,其免疫原性較弱且與給藥劑量相關(guān),1mg/kg和2mg/k
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