肺炎嗜衣原體CPAF重組蛋白致小鼠肺組織炎癥及對(duì)炎癥細(xì)胞因子影響的研究.pdf

1、目的:將本室構(gòu)建的肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)蛋白酶樣活性因子(Chlamydial protease–like activity factor,CPAF)的181～400aa基因(CPAFm)的重組表達(dá)體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行鑒定,研究該重組蛋白在 BALB/c小鼠體內(nèi)引起的肺部炎癥改變及對(duì)炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平的影響,為進(jìn)一步探索CPAF在Cpn感染中的致

2、病作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:重組質(zhì)粒pGEX6p-2/CPAFm,經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),采用SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物;復(fù)性后用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)瓊脂糖凝膠FF純化重組蛋白,A280紫外分光光度法測(cè)定純化蛋白濃度。將純化的重組蛋白第1d、3d、6d鼻內(nèi)或尾靜脈注射BALB/c小鼠,第7

3、d處死小鼠,HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變,常規(guī)血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)外周血與支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids,BALF)中白細(xì)胞總數(shù),瑞氏染色觀察外周血與BALF中白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù),ELISA方法檢測(cè)血漿和BALF中的TNF-α和IL-6的水平。
　　結(jié)果:重組目的基因表達(dá)菌在IPTG的誘導(dǎo)下,表達(dá)了相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約51.3 kDa的目的蛋白,目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以包涵體形式存在,經(jīng)

4、GST瓊脂糖凝膠FF純化得到純度達(dá)95％以上的重組蛋白。重組蛋白能引起B(yǎng)ALB/c小鼠肺組織的炎癥病理?yè)p傷,光鏡下見(jiàn)BALB/c小鼠的肺組織出現(xiàn)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),對(duì)照組與正常組BALB/c小鼠肺組織未見(jiàn)明顯病理改變。尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)組的BALB/c小鼠外周血中性粒細(xì)胞比例明顯高于GST、PBS對(duì)照組和正常組(均P﹤0.01),單核細(xì)胞比例明顯高于GST對(duì)照組(P﹤0.05)、PBS對(duì)照組(P﹤0.05)和正

5、常組(P﹤0.01);鼻內(nèi)滴入實(shí)驗(yàn)組 BALB/c小鼠 BALF中白細(xì)胞總數(shù)明顯高于 GST對(duì)照組(P﹤0.05)、PBS對(duì)照組(P﹤0.05)和正常組(P﹤0.01);鼻內(nèi)滴入實(shí)驗(yàn)組外周血中炎癥因子IL-6水平顯著高于GST、PBS對(duì)照組和正常組(均P﹤0.01),TNF-α水平明顯高于GST對(duì)照組(P﹤0.05)、PBS對(duì)照組(P﹤0.01)和正常組(P﹤0.01);尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)組外周血中炎癥因子IL-6的水平明顯高于GST、PB

6、S對(duì)照組與正常組(均 P﹤0.01);鼻內(nèi)滴入和尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)組 BALF中炎癥因子IL-6、TNF-α的水平明顯高于GST、PBS對(duì)照組與正常組(均P﹤0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、成功表達(dá)純化得到51.3 kDa的GST-CPAFm重組蛋白和26kDa的GST蛋白;
　　2、GST-CPAFm重組蛋白能引起B(yǎng)ALB/c小鼠肺組織的炎癥病理?yè)p傷;
　　3、GST-CPAFm重組蛋白能引起B(yǎng)ALB/c小鼠體內(nèi)