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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)為單股正鏈RNA病毒,全長(zhǎng)為9.6kb。目前全世界近3%的人口為HCV感染者,其中50-80%以上的患者由急性轉(zhuǎn)為慢性持續(xù)感染,甚至發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌。研究發(fā)現(xiàn)固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)均參與了HCV感染、清除及慢性化過程,但其確切機(jī)制尚不十分清楚。TIPE2(Tumor necrosis factor-α-inducedprotein8-like2,TN
2、FAIP8L2),即腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8型-2,是新近發(fā)現(xiàn)的一種免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要調(diào)節(jié)器。TIPE2是先天性免疫及獲得性免疫的負(fù)性調(diào)節(jié)者,在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用,也通過作用于Ras信號(hào)通路提供從炎癥到腫瘤的分子橋梁。先前的研究表明TIPE2不僅高表達(dá)于免疫細(xì)胞和組織,如淋巴結(jié)、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等,也表達(dá)于其他非免疫細(xì)胞,如腺上皮細(xì)胞、分層或假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。而且對(duì)人TIPE2特性的研究表明TIP
3、E2可能參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病腎病、慢性乙型肝炎、肝癌、腎癌等,但具體機(jī)制尚不清楚。Luan等應(yīng)用蛋白印跡法(Western blot)和RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),從BALB/C小鼠脾臟分離提取的CD4+CD25+Treg細(xì)胞(簡(jiǎn)稱Treg細(xì)胞)中可以檢測(cè)到TIPE2的表達(dá),且能增強(qiáng)Treg細(xì)胞的免疫抑制作用,提示TIPE2基因可能與Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)控機(jī)制有關(guān),但是其具體機(jī)制尚不十分清楚。Treg細(xì)胞是一群
4、具有免疫抑制作用的T細(xì)胞亞群,在感染、腫瘤免疫和移植中發(fā)揮了重要作用。據(jù)報(bào)道,Treg細(xì)胞可分泌免疫抑制因子從而直接抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的功能。在很多腫瘤疾病中,Treg細(xì)胞的廣泛浸潤(rùn)提示著預(yù)后差、生存率低。人叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子p3(forkhead/winged helix transcription factor p3,F(xiàn)OXP3)基因是轉(zhuǎn)錄因子forkhead/winged-helix家族成員之一,已被廣泛認(rèn)可是Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)記物
5、,是調(diào)控Treg細(xì)胞發(fā)育、分化及成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associatedantigen4,CTLA-4)是T細(xì)胞活化的負(fù)性調(diào)節(jié)子,是Treg細(xì)胞的細(xì)胞表面分子,對(duì)T細(xì)胞活化有著抑制作用。鑒于免疫系統(tǒng)內(nèi)TIPE2基因的正常表達(dá)可以有效的防止機(jī)體過度反應(yīng)和維持免疫穩(wěn)態(tài),我們推測(cè)TIPE2基因和FOXP3、CTLA-4在慢性丙型肝炎發(fā)病機(jī)制中具有某種關(guān)聯(lián)性。
6、 因此,本課題的主要目的是通過檢測(cè)TIPE2基因及FOXP3、CTLA-4在慢性丙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclearcells,PBMCs)中的表達(dá)情況,一方面了解慢性丙型肝炎患者PBMCs中TIPE2基因表達(dá)情況,另一方面探討TIPE2和FOXP3、CTLA-4在慢性丙型肝炎發(fā)病機(jī)制及進(jìn)展中的作用,為進(jìn)一步闡明TIPE2在慢性丙型肝炎發(fā)生和發(fā)展中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。
方法:<
7、br> 1病例選擇
慢性丙型肝炎患者60例,男31例,女29例,平均年齡49.40±14.31歲,均為2012年5月至2013年10月河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科門診及住院患者,診斷均符合2000年9月西安會(huì)議修訂的病毒性肝炎防治方案標(biāo)準(zhǔn)[1]及2004年丙型肝炎防治指南修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。同時(shí)排除其他合并病毒性肝炎及肝臟疾病。同期選擇健康志愿者42例,男12例,女30例,平均年齡為50.21±8.51歲。所有患者
8、及健康志愿者均清晨空腹抽取抗凝靜脈血7ml,用于分離PBMCs檢測(cè)。抽取不抗凝靜脈血5ml,分離血清備用。
2治療方法
所有慢性丙型肝炎患者均給予干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療,根據(jù)白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞減少情況,給予升白藥物治療。肝功能異常患者給予保肝降酶、退黃等治療。
3外周血單個(gè)核細(xì)胞中TIPE2、FOXP3、CTLA-4基因檢測(cè)
Ficoll密度梯度離心法常規(guī)分離PBMCs,Trizol一步法提
9、取PBMCs中的總RNA,利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA,吸光度(A)260/(A)280nm的值在1.8-2.0時(shí)用于實(shí)驗(yàn),利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成制備cDNA,應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)合成特異性引物,RT-PCR檢測(cè)TIPE2、FOXP3、CTLA-4 mRNA的表達(dá)。
4血清檢測(cè)
留取慢性丙型肝炎患者不抗凝靜脈血5ml,分離血清,全自動(dòng)生化儀酶法檢測(cè)肝功能,ELISA法測(cè)抗-HCV,實(shí)時(shí)熒光定量PCR
10、探針法檢測(cè) HCV-RNA。
結(jié)果:
1慢性丙型肝炎患者PBMCs中TIPE2基因的表達(dá)及與抗病毒治療的關(guān)系
結(jié)果顯示慢性丙型肝炎患者PBMCs中TIPE2 mRNA的表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著降低(0.50±0.19 vs0.71±0.17,P<0.01);其中21例慢性丙型肝炎患者在抗病毒治療前后分別檢測(cè),結(jié)果顯示PBMCs中TIPE2mRNA水平治療后較治療前明顯升高(0.48±0.12 vs0.59±
11、0.12,P<0.01)。
2慢性丙型肝炎患者PBMCs中FOXP3基因的表達(dá)及與抗病毒治療的關(guān)系
慢性丙型肝炎患者PBMCs中FOXP3 mRNA的表達(dá)水平較健康對(duì)照組明顯升高(0.77±0.38 vs0.40±0.09,P<0.01);21例慢性丙型肝炎患者在抗病毒治療前后分別檢測(cè),結(jié)果顯示PBMCs中FOXP3 mRNA水平治療后較治療前明顯下降(0.85±0.35 vs0.50±0.06,P<0.01)。
12、r> 3慢性丙型肝炎患者PBMCs中CTLA-4 mRNA基因的表達(dá)及與抗病毒治療的關(guān)系
慢性丙型肝炎患者PBMCs中CTLA-4 mRNA的表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著升高(0.67±0.19 vs0.44±0.13,P<0.01),21例慢性丙型肝炎患者抗病毒治療前后分別檢測(cè),結(jié)果顯示PBMCs中CTLA-4 mRNA水平治療后較治療前明顯下降(0.70±0.19 vs0.55±0.14,P<0.01)。
4 TI
13、PE2基因的表達(dá)與慢性丙型肝炎臨床指標(biāo)的相關(guān)性
分析慢性丙型肝炎患者臨床資料,依據(jù)慢性丙型肝炎患者血清中HCV-RNA、ALT、AST、TBil水平,將其分為HCV-RNA低水平組(HCV-RNA≤1×105IU/ml)和HCV-RNA高水平組(HCV-RNA>1×105IU/ml);ALT正常組(ALT≤40U/L)和異常組(ALT>40U/L);AST正常組(AST≤40U/L)和異常組(AST>40U/L)以及TBil正
14、常組(TBiL≤20μmol/L)和異常組(TBil>20μmol/L),統(tǒng)計(jì)分析顯示,慢丙肝患者PBMCs中TIPE2 mRNA的表達(dá)水平HCV-RNA在低水平組顯著高于高水平組(0.63±0.17 vs0.37±0.10,P<0.01),在ALT、AST、TBil正常組顯著高于異常組(ALT,0.61±0.17 vs0.37±0.10,P<0.01; AST,0.61±0.17 vs0.36±0.10,P<0.01; TBil,0.
15、59±0.18 vs0.36±0.10, P<0.01),且與ALT、AST水平呈負(fù)相關(guān)(ALT,r=-0.529,P<0.01;AST,r=-0.567,P<0.01),與HCV-RNA、TBil水平無明顯相關(guān)關(guān)系。
5 TIPE2的表達(dá)與FOXP3、CTLA-4表達(dá)的相關(guān)性
進(jìn)一步應(yīng)用SPSS13.0分析顯示,TIPE2的表達(dá)與FOXP3、CTLA-4呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為(FOXP3,r=-0.563,P<0.0
16、1, CTLA-4,r=-0.613,P<0.01)。
結(jié)論:
1慢性丙型肝炎患者PBMCs中TIPE2基因的表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照者,接受抗病毒治療后表達(dá)水平升高。
2慢性丙型肝炎患者PBMCs中FOXP3、CTLA-4基因的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照者,抗病毒治療后表達(dá)水平下降。
3 TIPE2基因表達(dá)水平影響肝細(xì)胞壞死和炎癥程度以及丙肝病毒復(fù)制。
4 TIPE2、FOXP3、CTL
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