姜黃素聯(lián)合表柔比星對(duì)HepG2細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路和FOXP3及TIPE2的影響.pdf

1、原發(fā)性肝癌（肝癌）是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)又是肝癌的高發(fā)區(qū)。肝癌起病隱匿，發(fā)展快，一旦發(fā)現(xiàn)多為中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。射頻消融，肝動(dòng)脈介入化療栓塞，無(wú)水酒精注射等治療手段臨床療效亦不理想。肝癌組織和肝癌細(xì)胞對(duì)我們常用的化療藥物如表柔比星、絲裂霉素、5-FU、順鉑等不敏感，化療的效果較差。中醫(yī)中藥可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。姜黃素是從姜黃的根莖中提取的活性成分，具有抗氧化、抗病毒、抗炎、預(yù)防和抑制腫

2、瘤生長(zhǎng)的作用，而且研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)腫瘤患者具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。姜黃素聯(lián)合現(xiàn)有的常用的化療藥物對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用和對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用目前尚不十分清楚。
　　 腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白-8樣分子2(Tumornecrosisfactor-alpha-inducedprotein-8like-2，TNFAIP8L2，TIPE2)是新近發(fā)現(xiàn)的重要的免疫分子，不僅可以負(fù)性調(diào)控獲得性免疫和固有免疫，而且被視為細(xì)胞免疫的重要調(diào)節(jié)者。

3、同時(shí)具有溝通炎癥和腫瘤的橋梁的作用，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。FOXP3(forkheadboxP3，F(xiàn)OXP3)是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，主要表達(dá)在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上，近年研究發(fā)現(xiàn)FOXP3亦可以表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中，具有促使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)督的作用。但他們?cè)谀[瘤細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響的研究尚不多見(jiàn)。
　　 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物表柔比星不僅可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而且可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞和免疫分子影響

4、抗腫瘤的免疫調(diào)節(jié)作用，但對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用尚不令人滿意，因此尋找有效的抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物和方法成為科研工作者的重點(diǎn)。人類的多種腫瘤如胃癌、大腸癌、乳腺癌、肝癌、腎癌都與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threoninekinase，AKT)信號(hào)通路密切相關(guān)。這條通路不但可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的炎癥因

5、子的表達(dá)，而且研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)通路還可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫分子干預(yù)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，我們通過(guò)體外培養(yǎng)HepG2肝癌細(xì)胞，單獨(dú)應(yīng)用表柔比星及聯(lián)合姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察這些藥物對(duì)HepG2細(xì)胞生存率，細(xì)胞中FOXP3，TIPE2表達(dá)及對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路分子的影響，來(lái)探討表柔比星單用或聯(lián)合姜黃素應(yīng)用是否可以影響TIPE2，F(xiàn)OXP3表達(dá)及對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響，并探討其分子機(jī)制。
　　 目

6、的:研究表柔比星單用或聯(lián)合姜黃素應(yīng)用對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路和相關(guān)分子TIPE2和FOXP3的影響，并探討其分子機(jī)制。
　　 方法:體外培養(yǎng)HepG2用于研究，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)48小時(shí)后給予不同濃度姜黃素5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L、80μmol/L進(jìn)行藥物干預(yù)，分別在24、48小時(shí)終止干預(yù)，并采用M

7、TT方法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，確定姜黃素起作用的最低濃度為20μmol/L。給予不同濃度表柔比星1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μgm/L進(jìn)行藥物干預(yù)，分別在24、48小時(shí)終止干預(yù)，確定表柔比星起作用的最低濃度為2μg/mL。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，分為對(duì)照組，表柔比星組（2μg/mL）、姜黃素（20μmol/L）聯(lián)合表柔比星（2μg/mL）組，以同樣的方法干預(yù)HepG2細(xì)胞，分別在24、48小時(shí)采用MT

8、T方法檢測(cè)細(xì)胞的存活率;取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為對(duì)照組、表柔比星組和姜黃素組，以同樣的方法和濃度的干預(yù)HepG2細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)HepG2細(xì)胞中TIPE2、PTEN、AKT、NF-κB、FOXP3的表達(dá);應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)HepG2細(xì)胞中PTEN和AKT蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、姜黃素、表柔比星及表柔比星聯(lián)合姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的影響:
　

9、　 MTT結(jié)果顯示:隨著姜黃素濃度和干預(yù)時(shí)間的增加，HepG2細(xì)胞的存活率逐漸下降，姜黃素濃度為5μmol/L和10μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率下降并不明顯，濃度為20μmol/L細(xì)胞生存率開(kāi)始迅速下降，因此確定20μmol/L為姜黃素最低有效濃度。24和48小時(shí)時(shí)姜黃素5μmol/L和姜黃素10μmol/L，姜黃素40μmol/L和姜黃素50μmol/L相比較，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)其余各組間比較，P＜0

10、.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表柔比星亦抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，隨著表柔比星干預(yù)的濃度和時(shí)間的增加，細(xì)胞的生存率也呈下降趨勢(shì)，確定表柔比星2μg/ml為最低有效濃度。表柔比星不同濃度各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各組間比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且MTT結(jié)果顯示表柔比星2μg/ml聯(lián)合姜黃素20μmol/L較單用表柔比星組細(xì)胞存活率明顯下降P＜.0.05，兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、表柔比星單獨(dú)及聯(lián)合姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞中

11、TIPE2、PTEN、AKT、NF-KB及FOXP3mRNA及PTEN、AKT蛋白影響:
　　 RT-PCR結(jié)果顯示:表柔比星組與對(duì)照組比較，表柔比星組AKT、NF-KB和FOXP3mRNA的表達(dá)下降（P＜0.05），PTEN和TIPE2mRNA的表達(dá)上升(P＜0.05)，二組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;姜黃素聯(lián)合表柔比星組和表柔比組相比較，聯(lián)合組AKT、NF-κB和FOXP3mRNA表達(dá)下降(P＜0.05)，PTEN和TIPE2mRNA

12、的表達(dá)上升(P＜0.05)，二組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 Western-blot結(jié)果顯示:表柔比星組與對(duì)照組比較，表柔比星組AKT蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)，PTEN蛋白表達(dá)上升（P＜0.05），二組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。姜黃素聯(lián)合表柔比星組和表柔比組相比較，聯(lián)合組AKT蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），PTEN蛋白表達(dá)上升(P＜0.05)，二組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:
　　 1、姜黃素及表柔比星以濃度和時(shí)間