免疫負(fù)調(diào)控基因TIPE2和A20在SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的:
　　 TIPE2(tumor necrosis factor-a induced protein8-like2)是2002年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)基因，人TIPE2基因位于染色體1q21.2-1q21.3，由184個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有與死亡受體結(jié)構(gòu)域(DED)相似的結(jié)構(gòu)域和6個(gè)保守的a螺旋結(jié)構(gòu)。TIPE2與TNFAIP8L1(TIPE1)和TNFAIP8L3(TIPE3)同屬于TNFAIP8家族。研究發(fā)現(xiàn)，TIPE2基因主要表達(dá)在胸

2、腺，脾臟，淋巴結(jié)以及小腸粘膜等免疫器官和淋巴組織中。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠TIPE2基因敲除后，會(huì)導(dǎo)致體重下降，多器官自發(fā)性炎癥，脾腫大，血清學(xué)檢測許多炎癥因子如IL-1，IL-6，IL-12，TNF-a等的表達(dá)水平均升高。TIPE2基因敲除后小鼠炎癥反應(yīng)加劇，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TIPE2抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，這些均證明它是一種新型的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)蛋白，在固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中均發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。但是，目前關(guān)于TIPE2的文獻(xiàn)報(bào)

3、道很少，而且主要是通過小鼠模型進(jìn)行的機(jī)制研究，該基因在人類的一些自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人(systemic lupus erythematosus， SLE)中的表達(dá)及其作用尚無研究。
　　 材料與方法:
　　 1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TIPE2基因的檢測。
　　 1.1、病例的選擇與標(biāo)本的收集；
　　 于2008年10月至2009年3月間，從山東大學(xué)齊魯醫(yī)院收集剛?cè)朐旱腟LE

4、病例資料，共計(jì)39例，全部符合1982年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ARA)修訂的SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估SLE的活動(dòng)指數(shù)(systemic lupus erythematosus diseaseactivity index， SLEDAI)為16.33±1.409。同時(shí)選取35例年齡和性別匹配的健康獻(xiàn)血者。
　　 1.2、外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA的抽提及cDNA的制備；
　　 Trizol法抽提外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，紫外分光光度

5、計(jì)測定RNA的純度及濃度，波長260/280nm處的吸光度(A）值為1.8～2.0時(shí)用于實(shí)驗(yàn)，并統(tǒng)一定量為2.0μ9。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。
　　 1.3、半定量RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測TIPE2基因的表達(dá)；
　　 根據(jù)PubMed中人TIPE2序列(GI：141802951)，根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則，應(yīng)用Premier Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，為避免基因組DNA的污染

6、，所設(shè)計(jì)引物均跨不同外顯子。應(yīng)用半定量RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測SLE患者和健康對照者新鮮分離的PBMCs中TIPE2 mRNA的表達(dá)。
　　 2.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞上TIPE2的表達(dá)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床參數(shù)以及MX1的相關(guān)性分析。
　　 利用Prism GraphPad軟件對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞上TIPE2的表達(dá)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床參數(shù)-SLEDA等水平以及MX1的相關(guān)性分

7、析。
　　 3.TIPE2的表達(dá)和Ⅰ型干擾素之間關(guān)系的分析。
　　 3.1、利用TIPE2的SiRNA干擾THP1細(xì)胞TIPE2 mRNA的表達(dá)；
　　 以脂質(zhì)體Lipofectamine2000為載體，用針對TIPE2特意靶點(diǎn)的SiRNA轉(zhuǎn)染入人單核細(xì)胞系THP1后，用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法檢測TIPE2，MX1，TNF-amRNA的表達(dá)。
　　 3.2、用不同濃度SLE病人的血清刺激THP1細(xì)

8、胞；
　　 分別用5％和25％濃度的SLE病人血清與THP1細(xì)胞共培養(yǎng)24h，同時(shí)用5％和25％濃度的健康人血清做對照，用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法檢測血清刺激24h后THP1細(xì)胞中TIPE2和MX1 mRNA的表達(dá)水平。
　　 4、地塞米松對TIPE2表達(dá)的影響。
　　 在24孔板中，將THP1細(xì)胞和分離的正常人外周血PBMC分別以1×106/ml鋪板，加入終濃度為1×10-6mol/L的地塞米松(dexa

9、methason，Dex)，并同時(shí)用PBS組作對照，分別刺激2h，12h，24h后，用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法檢測TIPE2 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、 SLE患者PBMCs中TIPE2和MX1 mRNA的表達(dá)及與SLE患者活動(dòng)指數(shù)的相關(guān)性分析。
　　 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法檢測SLE患者和健康對照者PBMC中TIPE2和MX1的mRNA的表達(dá)，以2-△△ct表示TIPE2和MX

10、1的表達(dá)。結(jié)果顯示SLE患者和健康對照者TIPE2的表達(dá)值分別為4.207±0.5772和8.620±1.128，SLE患者TIPE2 mRNA的表達(dá)水平顯著降低(p=0.0004);SLE患者和健康對照者M(jìn)X1的表達(dá)值分別為44.480±5.400和23.081±4.866，SLE患者M(jìn)X1 mRNA的表達(dá)水平顯著升高(p=0.0.0031)，MX1在SLE患者表達(dá)水平升高與文獻(xiàn)報(bào)道相符。
　　 2、利用TIPE2的SiRNA

11、干擾THP1細(xì)胞TIPE2 mRNA的表達(dá)后，MX1和TNF-a mRNA的表達(dá)情況
　　 利用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測針對TIPE2基因特異靶點(diǎn)的SiRNA對THP1細(xì)胞表達(dá)TIPE2 mRNA的干擾效果，結(jié)果表明干擾效率平均達(dá)到56.62％;干擾TIPE2 mRNA的表達(dá)后，MX1的表達(dá)降低，三次結(jié)果中，TIPE2干擾率高的與干擾率低的相比，MX1的表達(dá)相對增高；TNF-a的表達(dá)升高。
　　

12、3、與血清共培養(yǎng)后THP1細(xì)胞TIPE2和MX1 mRNA的表達(dá)。
　　 5％和25％血清刺激24h后，SLE患者血清組與正常對照組相比TIPE2的表達(dá)均有所降低，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯；MX1的表達(dá)均升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、藥物刺激。
　　 用地塞米松刺激THP1細(xì)胞和分離的正常人PBMCs，2h，12h，24h時(shí)分別與對照組相比TIPE2的表達(dá)均有有升高趨勢，且24h時(shí)顯著升高；用IFN-α2a和IF

13、N-α2b刺激THP1細(xì)胞，與對照組相比，MX1的表達(dá)升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TIPE2的表達(dá)無顯著變化。
　　 結(jié)論：
　　 1、 SLE患者PBMC中TIPE2 mRNA的表達(dá)水平與正常對照組相比顯著降低，并且與SLEDAI呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系；與已經(jīng)非常明確的并且在SLE發(fā)病過程中至關(guān)重要的IFN-I誘導(dǎo)的基因MX1的表達(dá)負(fù)性相關(guān)。
　　 2、當(dāng)細(xì)胞系THP1中TIPE2表達(dá)降低時(shí)，MX1的表達(dá)降低，TNF-a的表達(dá)

14、升高，這提示TIPE2作為TNF-a誘導(dǎo)的表達(dá)基因，它表達(dá)水平的降低可能反饋性地使TNF-a表達(dá)升高。
　　 3、地塞米松作為治療SLE疾病的一種藥物，參與控制SLE發(fā)病過程中對炎癥因子分泌的調(diào)控，降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)，TIPE2作為免疫系統(tǒng)的負(fù)性調(diào)控因子，在地塞米松刺激下表達(dá)水平升高，參與控制機(jī)體的炎癥反應(yīng)。
　　 綜合結(jié)果提示，TIPE2作為一種新發(fā)現(xiàn)的免疫負(fù)性調(diào)節(jié)因子，它的低表達(dá)有可能不能夠有效地對機(jī)體進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，

15、使許多炎癥因子的表達(dá)升高，參與SLE病人的發(fā)病進(jìn)程。TIPE2是新發(fā)現(xiàn)的基因，與疾病的關(guān)系尚不清楚，關(guān)于TIPE2與人類疾病的研究更少。本研究首先發(fā)現(xiàn)TIPE2在自身免疫性疾病SLE的PBMCs中，表達(dá)水平降低，且其降低的水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。SLE發(fā)病機(jī)制尚不明確，關(guān)于其的治療也有諸多限制。TIPE2作為新發(fā)現(xiàn)的免疫負(fù)性調(diào)控因子，可能為治療SLE疾病提供新的靶點(diǎn)。
　　 目的：
　　 鋅脂蛋白A20(zinc

16、finger protein A20)是近年來在細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)的一類新的蛋白質(zhì)。A20是體內(nèi)NF-κB信號(hào)系統(tǒng)重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，也是防止體內(nèi)炎癥反應(yīng)失控的重要免疫負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白。
　　 方法：
　　 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的技術(shù)檢測37例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞鋅脂蛋白A20的表達(dá)，同時(shí)與同期32例健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞鋅脂蛋白A20的表達(dá)做對照進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：

17、　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞鋅脂蛋白A20的表達(dá)水平較健康對照組明顯降低(p=0.0133)，而且活動(dòng)期病人與靜止期病人相比A20的表達(dá)顯著降低(p=0.0006)，狼瘡腎炎患者與非狼瘡腎炎患者相比表達(dá)也顯著降低(p=0.0188)；系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者鋅脂蛋白A20的表達(dá)水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的活動(dòng)指數(shù)、血沉呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.4661，p=0.0036;r=-0.5222，p=0.0009)。
　　 結(jié)論