microRNA-181a調(diào)控KRAS的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、目的：
　　宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在導(dǎo)致女性死亡的各類(lèi)惡性腫瘤中位居第四。明確宮頸癌的發(fā)病機(jī)制是預(yù)防、診斷和治療宮頸癌的關(guān)鍵。本研究旨在驗(yàn)證miR-181a在宮頸癌患者血液及癌組織中的表達(dá)情況，研究其對(duì)不同宮頸癌細(xì)胞株增殖、遷移能力及凋亡率的影響，探討miR-181a對(duì)KRAS基因的調(diào)控作用與宮頸癌的相關(guān)性，為宮頸癌發(fā)病機(jī)制研究和靶向治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用qRT-PCR方法

2、，在宮頸癌、癌旁組織以及宮頸癌患者血清中檢測(cè)miR-181a的表達(dá)水平；
　　2.采用qRT-PCR和Western blotting方法，在宮頸癌和癌旁組織中觀(guān)察KRAS的表達(dá)水平；
　　3.通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察上調(diào)或下調(diào)miR-181a后對(duì)不同宮頸癌細(xì)胞株增殖、遷移能力和凋亡率的影響以及KRAS表達(dá)量的變化；
　　4.通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，檢測(cè)miR-181a與KRAS之間的靶向結(jié)合關(guān)系。
　　結(jié)果：

3、r>　　1. miR-181a在宮頸癌新鮮組織中的相對(duì)表達(dá)水平為宮頸癌癌旁組織的0.06倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　2.宮頸癌患者血清樣本與無(wú)宮頸病變的健康女性血清樣本對(duì)比顯示，miR-181a在宮頸癌患者血清中低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　3.KRAS在宮頸癌新鮮組織中的表達(dá)水平是宮頸癌癌旁組織的2.22倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　4.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)

4、miR-181a的SiHa及HeLa細(xì)胞所形成的細(xì)胞增殖率分別為（20.54±3.40）％、（36.65±1.82）%；而下調(diào)miR-181a表達(dá)的SiHa及HeLa細(xì)胞增殖率分別為（69.23±4.25）%、（79.11±2.7）%，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　5.Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力結(jié)果顯示，上調(diào)miR-181a的SiHa及HeLa細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)分別為40.60±2.

5、84、40.00±3.51，明顯少于陰性對(duì)照組細(xì)胞（P<0.05）；而下調(diào)miR-181a后細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)量為113.80±4.50、77.60±3.54，與陰性對(duì)照組細(xì)胞比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　6.流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率顯示，當(dāng)上調(diào)miR-181a時(shí)，SiHa及HeLa細(xì)胞的凋亡率較陰性對(duì)照組明顯升高，分別為（47.86±2.04、46.66±4.40）%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而下調(diào)

6、miR-181a的SiHa及HeLa細(xì)胞凋亡率為（30.51±4.51）%、（17.67±2.39）%，與陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　7.在上調(diào)miR-181a的表達(dá)后，qRT-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SiHa和HeLa細(xì)胞中KRAS的mRNA及蛋白水平表達(dá)下調(diào)（P<0.05），而下調(diào)miR-181a后，KRAS在mRNA及蛋白水平表達(dá)均上調(diào)（P<0.05）；

7、>　　8.雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析證實(shí)，在轉(zhuǎn)染野生型片段的SiHa和HeLa細(xì)胞中，上調(diào)miR-181a能顯著抑制熒光素表達(dá)；當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)突變后，上述抑制作用喪失；
　　9.生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)和基因測(cè)序結(jié)果顯示，SNP rs9266(C>T)位于miR-181a與KRAS-3’-UTR靶向結(jié)合區(qū)域內(nèi)。
　　結(jié)論：
　　1.miR-181a在宮頸癌組織及宮頸癌患者血清中低表達(dá)；
　　2.KRAS在宮頸癌組織中高表達(dá)；<