Ras基因在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：本次實(shí)驗(yàn)我們選用7株不同來(lái)源（胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，胃癌肝轉(zhuǎn)移，胃癌腹水轉(zhuǎn)移和胃癌組織轉(zhuǎn)移）、不同分化程度的胃癌細(xì)胞和1株正常胃黏膜細(xì)胞，系統(tǒng)研究胃癌細(xì)胞中是否存在Ras家族新成員—ERas基因mRNA全長(zhǎng)的表達(dá)及表達(dá)差異，分析ERas基因全長(zhǎng)的突變情況以及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖，遷移和克隆形成能力的影響；同時(shí)系統(tǒng)研究傳統(tǒng)Ras家族成員Kras，Hras和Nras基因在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá),分析突變熱點(diǎn)12，13，61位密碼子的突變情況，從而進(jìn)

2、一步探索Ras基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起到的作用。
　　方法：實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)7株胃癌細(xì)胞（MKN-28，MN-45，BGC-823，NCL-N87，SNU-16，SGC-7901，AGS）和1株正常胃黏膜細(xì)胞（GES-1）中ERas基因全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，測(cè)序分析ERas基因全長(zhǎng)是否存在突變，real-time PCR檢測(cè) ERas基因表達(dá)水平差異，從中篩選出兩株高表達(dá) ERas基因的胃癌細(xì)胞MKN-28和 BGC-823；

3、進(jìn)一步利用 siRNA沉默 ERas基因表達(dá)后，分別通過(guò)CCK-8，Transwell，細(xì)胞劃痕和克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察ERas基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖，遷移，克隆形成能力的影響。運(yùn)用RT-PCR的方法檢測(cè)Kras，Hras和Nras基因在上述8株細(xì)胞中的表達(dá)情況，并對(duì)其突變熱點(diǎn)12，13，61位密碼子進(jìn)行測(cè)序分析，觀察是否存在突變。
　　結(jié)果：在上述7株胃癌細(xì)胞中均檢測(cè)到ERas基因全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，且呈差異性表達(dá)，BGC-823，MKN-28，

4、SNU-16和SGC-7901細(xì)胞中表達(dá)水平較高，分別是正常胃黏膜GES-1細(xì)胞表達(dá)水平的89.26倍，20.25倍，5.46倍和4.27倍；首次測(cè)序證實(shí)上述7株胃癌細(xì)胞中該基因全長(zhǎng)不存在突變；利用siRNA沉默MKN-28和BGC-823中的ERas基因，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除ERas基因后胃癌細(xì)胞的增殖能力降低，MKN-28細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siRNA30，siRNA32后72 h OD值分別由1.60±0.05降至1.28±0.10（

5、P<0.01）和1.35±0.10（P<0.01），96h OD值分別由2.09±0.09降至1.74±0.10（P<0.01）和1.64±0.11（P<0.01）；BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA30，siRNA32后72 h OD值分別由0.64±0.18降至0.30±0.08（P<0.01）和0.40±0.10（P<0.05），96 h OD值分別由1.57±0.07降至1.00±0.46（P<0.05）和1.20±0.19（P<

6、0.01）；Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲除 ERas基因后胃癌細(xì)胞的遷移能力減弱，MKN-28細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siRNA30，siRNA32后24 h遷移的細(xì)胞數(shù)目分別由163.5±9.19降至62.50±7.78（P<0.01）和71±11.31（P<0.05），48h后分別由350.5±13.44降至130.50±13.44（P<0.01）和146.5±12.02（P<0.01）；BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siRNA30，siRNA32后2

7、4 h遷移的細(xì)胞數(shù)目分別由155.50±9.19降至50±4.24（P<0.01）和60.5±9.19（P<0.05），48 h后分別由255±8.49降至69.5±4.95（P<0.01）和86±8.49（P<0.01）；劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，敲除ERas基因后胃癌細(xì)胞的遷移能力減弱，MKN-28，BGC-823細(xì)胞在24 h，48 h，72 h和96 h劃痕修復(fù)速度顯著降低，其中在48 h最具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)染siRNA30和siRN

8、A32的 MKN-28細(xì)胞劃痕修復(fù)率分別從61.35％±3.54%降至25%±6.25%(P<0.001)和28.89%±3.85%（P<0.001），BGC-823分別從58.13%±3.61%降至19.61%±3.78%（P<0.001)和18%±3.85%（P<0.001）；克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除ERas基因后胃癌細(xì)胞的克隆形成能力減弱，轉(zhuǎn)染siRNA30和siRNA32沉默ERas基因后，MKN-28細(xì)胞克隆數(shù)分別從413±11

9、.3降至237±12.73（P<0.01）和254±9.90（P<0.01），BGC-823分別從318.5±12.02降至166±9.90（P<0.01）和180±12.73（P<0.01）。上述結(jié)果顯示，ERas基因具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，遷移，克隆形成的能力。
　　傳統(tǒng)Ras基因在胃癌細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)，其中Hras和Nras基因在各株胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平無(wú)明顯差異，而Kras基因則呈差異性表達(dá)，在MKN-28，NCL-N

10、87，SGC-7901中表達(dá)較高，且在MKN-28，BGC-823，SNU-16和SGC-7901細(xì)胞中除檢測(cè)到543 bp的目的條帶外還檢測(cè)到一條約400 bp的條帶，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為一新發(fā)現(xiàn)的Kras基因剪接型，特點(diǎn)為缺失第二外顯子，第一、三外顯子直接拼接，命名為KrasΔE2。測(cè)序分析Ras基因突變熱點(diǎn)12，13，61位密碼子，除GES-1細(xì)胞Kras基因第12位密碼子由甘氨酸變?yōu)榻z氨酸外，7株胃癌細(xì)胞中均未檢測(cè)到傳統(tǒng)Ras基因的熱點(diǎn)

11、突變。
　　結(jié)論：ERas基因在胃癌細(xì)胞中呈活化狀態(tài)，具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，遷移，克隆形成的能力，與胃癌發(fā)生存在一定關(guān)系；但該基因的活化并不是通過(guò)基因突變導(dǎo)致的；ERas基因有望成為胃癌檢測(cè)的一個(gè)新指標(biāo)或胃癌治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。
　　傳統(tǒng)Ras基因在胃癌細(xì)胞中均有不同程度的活化，其中Hras和Nras表達(dá)均一，而Kras則呈差異性表達(dá)，可能Kras與胃癌的關(guān)系更為密切；與在其它腫瘤中不同，胃癌細(xì)胞中Ras基因并不是通過(guò)熱點(diǎn)突變