Filamin A調(diào)控EGFR活化對三陰乳腺癌細胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，因其發(fā)病率、死亡率高，嚴重危害女性健康。乳腺癌作為一種異質(zhì)性疾病，其中三陰乳腺癌(triple-negativebreast cancer，TNBC)是指雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體-2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER-2)均陰性的乳腺癌

2、，是近年來研究最廣泛的一種類型，約占所有乳腺癌的20％，多見于年輕女性患者，腫瘤惡性程度高，易出現(xiàn)局部或遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后最差。隨著分子生物學(xué)時代的到來，TNBC同樣作為一種異質(zhì)性群體存在，根據(jù)基因表達譜的分析，其中一小部分TNBC屬于乳腺癌分子分型中的正常乳腺樣型，此型乳腺癌EGFR表達陰性且預(yù)后良好，而其余80％的TNBC屬于基底細胞樣型（即Basal-like型），此型EGFR表達陽性且預(yù)后最差。如何對TNBC實施有效的治療，已

3、成為乳腺癌治療的重點和難點。針對這一嚴峻形勢，進一步探索TNBC發(fā)病機制，尋找有效的乳腺癌治療方法勢在必行。
　　表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)屬于受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族，包括四大成員:ErbB-1/EGFR、ErbB-2/HER-2、ErbB-3/HER-3和ErbB-4/HER-4，是與乳腺癌關(guān)系最為密切的一

4、類生長因子受體。表皮生長因子受體通過與配體(如EGF)結(jié)合形成同源或異源二聚體，進一步激活多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAPK/ERK、PI3K/Akt等，發(fā)揮促進腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成作用。其中EGFR是此家族中最重要的成員。研究報道，EGFR是一種與乳腺癌進展和預(yù)后不良相關(guān)的標志性分子。35％-50％的乳腺癌中EGFR呈高表達，特別是三陰乳腺癌患者普遍伴有EGFR過表達。因此，在EGFR過表達的TNBC中，EGFR將成為一個很有吸引

5、力的治療靶點。目前針對EGFR的分子靶向藥物如西妥昔單抗等已應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療，但其單獨應(yīng)用有效率不高且伴有耐藥問題，提示在EGFR過表達的乳腺癌中可能還有其它的分子影響EGFR信號通路活化，在乳腺癌的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。
　　細絲蛋白A(Filamin A，F(xiàn)LNa)又稱ABP-280，是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白。在細胞漿內(nèi)廣泛分布，也可跨膜或于細胞核內(nèi)存在。FLNa是“V”形的同型二聚體，由肌動蛋白結(jié)合區(qū)、24個重復(fù)β-折疊片

6、層結(jié)構(gòu)以及兩個絞鏈區(qū)組成。FLNa的特殊結(jié)構(gòu)決定其具有強大的功能:其分子可交聯(lián)肌動蛋白絲形成穩(wěn)定的細胞骨架，并與多種細胞膜蛋白結(jié)合，影響如MAPK/ERK、PI3K/Akt等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而影響腫瘤細胞的增殖、粘附、遷移和侵襲等行為。Zhu等認為FLNa可以調(diào)控人黑色素瘤細胞EGFR的活化，而FLNa是否也影響TNBC細胞EGFR的活化目前尚無報道。
　　本研究擬通過:(1)采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立沉默F(xiàn)LNa的三陰乳腺癌MD

7、A-MB-436穩(wěn)定細胞株;(2)采用MTT比色分析法、劃痕修復(fù)實驗、Transwell法以及明膠酶譜法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的增殖、遷移和侵襲能力;(3)采用Western blot法，檢測EGFR及其下游信號通路中各激酶的活化水平。旨在從細胞、分子水平分析FLNa對TNBC細胞MDA-MB-436增殖、遷移和侵襲的影響，探討FLNa調(diào)控EGFR活化及其下游信號分子的作用機制，為更有效治療TNBC提供新靶點。
　　方法:
　　

8、1.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立沉默F(xiàn)LNa的穩(wěn)定細胞株將FLNa shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人TNBC細胞MDA-MB-436，經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選，得到沉默F(xiàn)LNa的穩(wěn)定細胞株(MDA-MB-436/KD)及其對照組細胞(MDA-MB-436/Ctrl);利用實時定量PCR(RT-PCR)和Western blot檢測穩(wěn)定細胞株中FLNa mRNA和FLNa蛋白的水平。
　　2.MTT比色分析法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的增殖能力將MDA-MB-436/K

9、D及MDA-MB-436/Ctrl細胞分別接種于96孔板，經(jīng)不同濃度EGF(0nM、4nM、20nM、100nM)刺激培養(yǎng)48h后，加入MTT，測定各孔吸光度(OD)值，檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的增殖能力。
　　3.劃痕修復(fù)實驗檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的遷移能力將MDA-MB-436/KD及MDA-MB-436/Ctrl細胞分別接種于24孔板，用無胎牛血清的1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)4h，用10μl移液器吸頭劃痕，兩種細胞分別分為無EGF刺激組和

10、20nM EGF刺激組;在倒置顯微鏡下觀察并拍照，直至劃痕愈合。
　　4.Transwell法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的侵襲能力將基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室，將MDA-MB-436/KD及MDA-MB-436/Ctrl兩組細胞分別接種于上室，在無胎牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，下室放入含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后;取出小室，并且用95％冰乙醇固定、HE染色，顯微鏡下拍照并計數(shù)穿膜細胞數(shù)。
　　5.明膠

11、酶譜法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的侵襲能力將MDA-MB-436/KD及MDA-MB-436/Ctrl細胞分別接種于35mm培養(yǎng)皿，用無胎牛血清的1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)4h，兩種細胞分別分為無EGF刺激組和20nM EGF刺激組，培養(yǎng)16h后收集上清;采用明膠酶譜法測定上清中MMP-9蛋白的活性。
　　6.Western blot檢測EGFR活化水平及其下游信號通路分子的變化將MDA-MB-436/KD及MDA-MB-436/Ctrl細胞

12、分別接種于35mm培養(yǎng)皿，用無胎牛血清的1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)4h，經(jīng)20nM EGF刺激后。于不同時間(0min、5min、10min、30min)收集細胞，提取總蛋白;采用Western blot檢測FLNa、p-EGFR、EGFR、p-Akt、Akt、p-ERK及ERK的水平。
　　結(jié)果:
　　1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中FLNa的水平檢測
　　1.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞FLNa mRNA的水平采用RT-PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞F

13、LNa mRNA的水平，結(jié)果顯示，MDA-MB-436/KD細胞FLNa mRNA的相對定量值(0.23±0.01)明顯低于MDA-MB-436/Ctrl細胞(1.00±0.00)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　1.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞FLNa蛋白的水平采用Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞FLNa蛋白的水平，結(jié)果顯示，MDA-MB-436/KD細胞FLNa的相對表達量（0.33±0.09）明顯低于MDA-MB-436/C

14、trl細胞(1.20±0.04)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞增殖、遷移和侵襲情況
　　2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖情況采用MTT法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖能力，結(jié)果顯示:不同濃度EGF(0nM、4nM、20nM、100nM)刺激的MDA-MB-436/KD組細胞的OD值(1.26±0.03，1.39±0.01，1.55±0.02，1.82±0.04)明顯高于MDA-MB-436/Ctrl組(0.88±0

15、.02，0.98±0.03，1.07±0.14，1.38±0.09)，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的遷移情況利用劃痕修復(fù)實驗檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的遷移能力，結(jié)果顯示:無EGF刺激時，MDA-MB-436/KD組各時間點的遷移率（23.06±0.14％，23.26±0.14％，39.62±0.04％，47.16±0.16％）均明顯高于MDA-MB-436/Ctrl組（7.85±1.08％，7.85±1.87

16、％，12.15±0.53％，20.93±1.39％），均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);給予20nM EGF刺激時，MDA-MB-436/KD組各時間點的遷移率（30.16±0.62％，36.59±0.77％，42.87±1.53％，50.00±0.00％）同樣均明顯高于MDA-MB-436/Ctrl組(13.34±0.51％，14.38±1.18％，15.80±1.56％，25.65±0.43％)，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

17、r>　　2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的侵襲情況
　　2.3.1 采用Transwell法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的侵襲能力，結(jié)果顯示:MDA-MB-436/KD組穿膜細胞數(shù)(154±5)明顯高于MDA-MB-436/Ctrl組(70±4)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.3.2 采用明膠酶譜法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞MMP-9蛋白的活性，結(jié)果顯示:無EGF刺激時，MDA-MB-436/KD組MMP-9蛋白的活性(1.00±0.00)明顯高于

18、MDA-MB-436/Ctrl組(0.10±0.03)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);給予20nM EGF刺激時，MDA-MB-436/KD組MMP-9蛋白的活性（2.30±0.17）同樣明顯高于MDA-MB-436/Ctrl組（0.24±0.02），具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);
　　3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞EGFR活化水平及其下游信號通路分子的變化利用Western blot檢測EGF刺激0min、5min、10min、30min

19、后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中各蛋白的水平，結(jié)果顯示:MDA-MB-436/KD組各時間點FLNa的表達量（0.22±0.02，0.25±0.03，0.22±0.02，0.23±0.04）均明顯低于MDA-MB-436/Ctrl組（0.82±0.03,0.83±0.03,0.82±0.03,0.84±0.03），均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);經(jīng)EGF刺激5min、10min、30min后p-EGFR的水平（0.83±0.02，0.71±0.05，0

20、.59±0.03）均明顯高于對照組（0.42±0.05，0.17±0.01，0.07±0.03），均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);p-Akt的水平（0.84±0.05，0.63±0.04，0.46±0.03）均明顯高于對照組（0.44±0.03，0.24±0.03，0.06±0.02），均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;p-ERK的水平（0.83±0.02，0.86±0.02，0.79±0.02）均明顯高于對照組（0.44±0.04，0.