RNA干擾EP-CAM基因表達對膽囊癌細胞生物學行為的影響.pdf

1、達量分別為0.2580±0.0195、0.8113±0.0107、0.3707±0.0194、0.4540±0.0132，均明顯低于空白對照組及陰性對照組(分別為0.9413±0.0103、0.9343±0.0185， P<0.01)；Western Blot結果顯示， pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR–EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-2、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EP

2、CAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4轉染組細胞中EP-CAM蛋白的相對表達量分別為0.1998±0.0214、0.6920±0.0225、0.3157±0.0175、0.4079±0.0239，亦均明顯低如空白對照組及陰性對照組（分別為0.7969±0.0160、0.8093±0.0137， P<0.01）；其中pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1質粒的干擾效果最佳，對mRNA和蛋

3、白表達的抑制率分別為(72.6±2.0)％和(74.9±2.1)％。3、用干擾效果最佳的pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1轉染GBC-SD細胞后：①顯微鏡下觀察，干擾組、空白對照組及陰性對照組細胞的形態(tài)無明顯差異；②MTT法顯示，與空白對照組及陰性對照組相比干擾組細胞的增殖活性受到明顯抑制（P<0.05）；③流式細胞儀檢測顯示，空白對照組、陰性對照組及干擾組細胞的凋亡率分別為（9.56±0.77）%、（10.57

4、±0.76）%、（10.03±0.57）%，三者之間的差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。④Transwell侵襲實驗結果表明，干擾組的穿膜細胞數為（57±7）明顯少于空白對照組及陰性對照組（分別為107±9,102±12;P<0.01）。
　　結論：1、靶向EP-CAM基因的特異性miRNA能有效地降解EP-CAM基因mRNA、抑制EP-CAM蛋白的表達。2、RNAi技術沉默人膽囊癌GBC-SD細胞中EP-CAM基因表達，能有效地

5、抑制GBC-SD細胞的增殖活性及侵襲力。3、EP-CAM基因可能成為膽囊癌基因治療的潛在靶點。
　　目的:利用RNA干擾技術沉默膽囊癌GBC-SD細胞中上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EP-CAM）基因的表達，探討沉默EP-CAM基因表達對GBC-SD細胞形態(tài)、增殖、凋亡及侵襲力的影響，為膽囊癌的基因治療提供一定的理論基礎和試驗依據。
　　方法：1、根據Genebank

6、 accession number：BC014785提供的基因序列，利用invitrogen公司的在線RNAi設計工具,設計針對EP-CAM基因不同位點的4個特異性miRNA干擾序列；將選擇的序列和相應的基因組數據庫進行BLAST序列比對，確信所選擇的序列與其他的基因不具有同源性；以鼠miR-155為骨架構建4個針對EP-CAM基因的特異性miR RNAi表達質粒，并進行DNA測序驗證。2、用Lipofect-amine?2000介導分

7、別將pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1、-2、-3、-4轉染人膽囊癌GBC-SD細胞株，試驗另設陰性對照組（轉染pcDNA?6.2-GW/-EmGFPmiR-neg）及空白對照組（未轉染組），瞬轉48h后分別用RT-PCR和Western Blot檢測各組GBC-SD細胞中EP-CAM的mRNA及蛋白的表達情況，篩選出干擾效率最強的一個miR RNAi表達質粒。3、用干擾效率最強的pcDNA?6.2-GW/EmG

8、FPmiR–EPCAM-1轉染GBC-SD細胞作為干擾組，觀察GBC-SD細胞的生物學行為變化：①顯微鏡觀察轉染前后細胞形態(tài)學的變化；②MTT法檢測細胞增殖的變化；③Annexin V/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡的變化；④Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲力的變化。
　　結果：1、DNA測序分析證實，表達質粒pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM

9、-2、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4中的插入片段序列均與設計的miRNA oligo序列一致，4個針對EP-CAM基因的miR RNAi表達載體均構建成功。2、轉染48h后， RT-PCR結果顯示， pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-2、pcDNA?6.2-GW/EmG

10、FPmiR-EPCAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4轉染組中EP-CAM mRNA的相對表達量分別為0.2580±0.0195、0.8113±0.0107、0.3707±0.0194、0.4540±0.0132，均明顯低于空白對照組及陰性對照組(分別為0.9413±0.0103、0.9343±0.0185， P<0.01)；Western Blot結果顯示， pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR–

11、EPCAM-1、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-2、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-3、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-4轉染組細胞中EP-CAM蛋白的相對表達量分別為0.1998±0.0214、0.6920±0.0225、0.3157±0.0175、0.4079±0.0239，亦均明顯低如空白對照組及陰性對照組（分別為0.7969±0.0160、0.8093±0.

12、0137， P<0.01）；其中pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1質粒的干擾效果最佳，對mRNA和蛋白表達的抑制率分別為(72.6±2.0)％和(74.9±2.1)％。3、用干擾效果最佳的pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-EPCAM-1轉染GBC-SD細胞后：①顯微鏡下觀察，干擾組、空白對照組及陰性對照組細胞的形態(tài)無明顯差異；②MTT法顯示，與空白對照組及陰性對照組相比干擾組細胞的增殖活性受到明顯抑制（

13、P<0.05）；③流式細胞儀檢測顯示，空白對照組、陰性對照組及干擾組細胞的凋亡率分別為（9.56±0.77）%、（10.57±0.76）%、（10.03±0.57）%，三者之間的差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。④Transwell侵襲實驗結果表明，干擾組的穿膜細胞數為（57±7）明顯少于空白對照組及陰性對照組（分別為107±9,102±12;P<0.01）。
　　結論：1、靶向EP-CAM基因的特異性miRNA能有效地降解EP-