HIF-1α對(duì)宮頸癌細(xì)胞SiHa生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：重組質(zhì)粒pcDNA3.1-full length HIF-1α、pcDNA3.1-dominant negativeHIF-1α、空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染人宮頸癌SiHa細(xì)胞，觀察各組SiHa細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)、VEGF蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡情況，以及不同CoCl<,2>化學(xué)缺氧條件下SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)情況的，以探討HIF-1α在SiHa細(xì)胞的血管生成、

2、缺氧保護(hù)、凋亡、增殖過(guò)程中的作用，為今后深入研究宮頸癌發(fā)病機(jī)制、開(kāi)展基因治療打下基礎(chǔ)。 方法： 1.構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-full lengthHIF-1α，擴(kuò)增重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-dominant negative HIF-1α，并進(jìn)行酶切、測(cè)序鑒定。 2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-dominant negative HIF-1α、 pcDNA3.1-full length H

3、IF-1α和空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入SiHa細(xì)胞，經(jīng)抗生素G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染dominant negative HIF-1α和full length HIF-1α基因的細(xì)胞單克隆，分別命名為dn HIF-1α組、fL HIF-1α組、pcDNA3.1組。 3.采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blot檢測(cè)dn HIF-1α組、fL HIF-1α組、pcDNA3.1組與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)在蛋白水平的差異，并進(jìn)

4、一步觀察其中VEGF表達(dá)的變化，以了解其與HIF-1α基因的關(guān)系。 4.光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。 5. 采用原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)200μmol/L COCl<,2>處理48小時(shí)細(xì)胞凋亡情況。 6.不同濃度COCl<,2>(0，50，100，150，200μmol/L)處理細(xì)胞，MTT法觀察其生長(zhǎng)增殖情況。 結(jié)果： 1.酶切和序列測(cè)定顯示，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-dominant

5、negative HIF-1α和pcDNA3.1-full length HIF-1α中的目的基因插入正確。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，fL HIF-1α組、dn HIF-1α組、pcDNA3.1組和未轉(zhuǎn)染組HIF-1α蛋白的積分光密度(IOD)值分別為：97728.298，3055.799，4295.064，4543.741，fL HIF-1α組與其他三組比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；dn HIF-1α組與其他三組的

6、差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。fL HIF-1α組、dn HIF-1α組、pcDNA3.1組和未轉(zhuǎn)染組VEGF蛋白的IOD值分別為：12945.65，6581.310，6638.807，7183.682，fLHIF-1α組與其他三組比，dn HIF-1α組與其他三組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3.Western blot結(jié)果顯示，fL HIF-1α組、dn HIF-1a組、pcDNA3.1組和未轉(zhuǎn)染組VEGF

7、的相對(duì)量分別為2.09，1.05，1.35，1.44，fL HIF-1α組與其他三組比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，dn HIF-1α組與其他三組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，未轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。fL HIF-1α組、dn HIF-1α組、pcDNA3.1組和未轉(zhuǎn)染組HIF-1α/Tubulin-β的灰度比分別為：1.29，0.72，0.77，0.79，fL HIF-1α

8、組與其他三組比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；dn HIF-lα組與其他三組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4.光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，正常氧條件下培養(yǎng)的各組SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)良好。Cocl<,2>(200μmol/L)處理48小時(shí)后，各組細(xì)胞均發(fā)生凋亡，但dn HIF-1α組細(xì)胞凋亡最明顯，細(xì)胞變小、皺縮，核固縮，細(xì)胞碎片、脫落、漂浮細(xì)胞增多。fL HIF-1α組僅有少量細(xì)胞發(fā)生凋亡較多細(xì)胞處于分裂期。 5

9、.TUNEL結(jié)果顯示，fL HIF-1α組、dn HIF-1α組、pcDNA3.1組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率分別為：22.52％，66.86％，36.12％，38.0％，fLHIF-1α組與其他三組比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，dn HIF-1α組與其他三組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，，未轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 6.MTT結(jié)果顯示，正常氧培養(yǎng)和CoCl<,2>條件下

10、，fL HIF-1α組細(xì)胞增殖能力均明顯高于dn HIF-1α組、pcDNA3.1組、未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。dn HIF-1α組增殖能力低于其他3組(P<0.05)。pcDNA3.1組與未轉(zhuǎn)染組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論： 1.酶切和DNA測(cè)序證實(shí)pcDNA3.1-full length HIF-1α真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。 2.full length HIF-1α能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖并阻止COCl<,2>化學(xué)缺氧引起