狼瘡骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和免疫治療研究.pdf

1、全文分為三部分： 第一部分 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的生物學(xué)特性和造血支持作用 目的：研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者骨髓問質(zhì)干細(xì)胞(MSC)生物學(xué)特性、染色體核型異常與否、多種細(xì)胞因子在mRNA水平的表達(dá)情況，以及：MSc在體內(nèi)對造血支持的影響。探討MSC異常在SLE發(fā)生、發(fā)展中的作用。 方法：抽取11例SLE患者和6例正常人骨髓，F(xiàn)icoll(1.077g/L)密度梯度離心，接種于含10％胎牛血清的L-DME

2、M完全培養(yǎng)液，置5％CO<,2>、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱，2～3天換液去除非貼壁細(xì)胞，90％融合時(shí)0.25％胰酶消化傳代。取P2代細(xì)胞消化后與FITC或PE標(biāo)記的鼠抗人CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CDl05、HLA-DR抗體作用，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。對P2代細(xì)胞采用秋水仙素終止法原位收獲MSC染色體，顯微鏡行染色體核型分析。取P2代細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，通過消化計(jì)數(shù)法繪制12天MSC生長曲線。取P2代細(xì)胞，Trizol

3、試劑盒提取細(xì)胞總RNA，半定量RT-PCR方法在mRNA水平上檢測SLE患者骨髓中白細(xì)胞介素-6(IL-6)，IL-7，IL11，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和干細(xì)胞因子(SCF)細(xì)胞因子的表達(dá)。取P2代細(xì)胞輸注CTX 50mg·kg<'-1>預(yù)處理的ICR小鼠，分為SLE患者M(jìn)SC輸注組、正常人MSC輸注組，對照組(輸注生理鹽水)，觀察正常人和SLE患者骨髓MSC對小鼠造血支持的影響。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分

4、析計(jì)算。 結(jié)論：建立SLE患者骨髓MSC分離、培養(yǎng)體系。SLE患者M(jìn)SC表達(dá)CD29、CD44、CD105，而不表達(dá)CD14、CD34、CD45和HLA-DR，P2代后細(xì)胞均一性較高。SLE患者M(jìn)SC體外生長存在缺陷，在染色體核型方面無原發(fā)缺陷。SLE患者M(jìn)SC細(xì)胞因子分泌異常，可能造成SLE造血系統(tǒng)受損和免疫系統(tǒng)紊亂。SLE患者M(jìn)SC可促進(jìn)小鼠早期造血恢復(fù)。為臨床選擇MSC移植治療SLE提供了依據(jù)。 第二部分 MSC對

5、T、B淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié) Ⅰ、MSC對T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié) 目的：探討狼瘡鼠(MRL/lpr)及正常鼠(C57BL/6)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)體外生物學(xué)特性、對T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的影響。 方法：采用直接貼壁法分離培養(yǎng)擴(kuò)增兩種鼠系骨髓MSC，流式細(xì)胞術(shù)鑒定MSC表面標(biāo)記物，觀察MSC生長狀況并繪制生長曲線；取C57BL/6鼠脾臟細(xì)胞，經(jīng)尼龍毛柱分選CD3+T淋巴細(xì)胞，

6、經(jīng)刀豆蛋白A(ConA)刺激，取正常及狼瘡鼠MSC或MSC培養(yǎng)上清與T細(xì)胞共培養(yǎng)72h，然后CFSE染色測定T細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測共培養(yǎng)前后T細(xì)胞活化及T細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)論：狼瘡鼠MSC在體外生長上存在異常，但對T細(xì)胞增殖、活化、凋亡免疫調(diào)節(jié)無異常。 Ⅱ、MSC對B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié) 目的：探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)體外對B淋巴細(xì)胞的免

7、疫調(diào)節(jié)作用是否存在異常。 方法：采用直接貼壁法分離培養(yǎng)正常人及SLE患者M(jìn)SC。免疫磁珠法分選正常人外周血B淋巴細(xì)胞，與MSC共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測B細(xì)胞凋亡及表面標(biāo)志表達(dá)，[<'3>H]摻入法檢測B細(xì)胞增殖，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測培養(yǎng)上清中免疫球蛋白IgG、IgM和IgA水平。 結(jié)論：MSC在體外對B細(xì)胞有抑制作用，SLE患者骨髓MSC與正常MSC相比，對B細(xì)胞的表面刺激分子表達(dá)、增殖、Ig分泌有相似的抑制作

8、用。 第三部分 人骨髓MSC移植治療MRL/lpr狼瘡鼠 目的：探討人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)移植對MRL/lpr狼瘡鼠的療效及作用機(jī)制。 方法：體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增正常人MSC。MRL/lpr鼠隨機(jī)分為環(huán)磷酰胺(CTX)治療組、MSC治療組和MSC+CTX治療組。16周齡時(shí)，CTX組和MSC+CTX組給予CTX100mg/kgx2d腹腔注射，24h后MSC組和MSC+CTX組經(jīng)尾靜脈移植,&MSC。考馬斯亮藍(lán)法