版納微型豬近交系骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化后的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景 免疫抑制劑在器官移植和自身免疫性疾病的臨床治療中起著舉足輕重的作用。但是，免疫抑制劑的副作用，包括免疫抑制引起的感染、腫瘤發(fā)生率增加等，也一直困擾著臨床醫(yī)生。在器官移植中，誘導(dǎo)受者對異基因移植物的特異性免疫耐受，減少、甚至撤除免疫抑制劑，一直是免疫學(xué)家和臨床醫(yī)生的一個夢想。這也是理論上解決異基因移植排斥，移植物抗宿主病等臨床問題的最佳方案。 在器官或組織移植中，穩(wěn)定嵌合與特異性耐受誘導(dǎo)密切相關(guān)。已有報道，骨髓間

2、充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞聯(lián)合移植在受者體內(nèi)可檢測到穩(wěn)定的造血系嵌合，并能誘導(dǎo)對供者的特異性耐受。但骨髓移植前預(yù)處理的毒性、移植失敗的風(fēng)險和移植后出現(xiàn)的急、慢性移植物抗宿主病等問題，使骨髓移植仍然局限于惡性腫瘤或嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病的患者，不適合用于特異性免疫耐受的誘導(dǎo)。最近報道，在未作任何預(yù)處理的大鼠中，胚胎樣干細(xì)胞移植后在其體內(nèi)可建立造血嵌合，并能誘導(dǎo)對隨后相同供者來源的心臟移植物的特異耐受。這一發(fā)現(xiàn)對尋找理想的免疫耐受誘導(dǎo)方法的研究者是一

3、個很大的鼓舞。 最近，我們以及其他實(shí)驗室都觀察到骨髓源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcell，MSC)不僅具有多向分化潛能，使其成為分化和發(fā)育的重要研究材料；又因其低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)活性，使其成為細(xì)胞移植治療的重要目標(biāo)細(xì)胞。Koc ON等(1999)、Devine SM等(2000)、Bartholomew A等(2002)、Bartholomew A等(2003)也相繼報道了相近的實(shí)驗結(jié)果。在小鼠和靈長類動

4、物中，輸注MSC可以延長異基因皮膚移植物的存活。在造血系統(tǒng)惡性腫瘤患者接受骨髓干細(xì)胞移植的同時輸注供者來源的MSC，觀察到MSC移植組的移植物抗宿主病(graft versushost disease，GVHD)發(fā)生率明顯低于未移植MSC組。這些初步的結(jié)果都為MSC的免疫調(diào)節(jié)特性提供了直接的證據(jù)。 據(jù)統(tǒng)計20％的患者因為得不到合適的器官供體，不能進(jìn)行器官移植而喪失生命。這種狀況一直激勵著科學(xué)家對非人源器官移植進(jìn)行可能性研究，后來

5、發(fā)現(xiàn)異種移植是解決器官移植中供體缺乏的有效手段之一。研究表明，豬在正常解剖、生理以及疾病的發(fā)生機(jī)理方面均與人很類似，豬的器官與人的器官大小相仿且發(fā)生人豬共患疾病的可能性很小，被認(rèn)為是人類臨床異種器官移植的首選供體。而近交系小型豬因具有基因純合度高，遺傳背景清楚等優(yōu)點(diǎn)而成為異種器官移植研究領(lǐng)域中不可代替的實(shí)驗?zāi)Ｐ?，甚至可能是異種器官移植中組織和器官的最可靠提供者。近交系豬因具有相同的基因型，表現(xiàn)型也一致，在生長發(fā)育的一定階段器官有一定的規(guī)

6、格，可以根據(jù)不同的需要選擇不同階段的近交系實(shí)驗動物進(jìn)行異體器官移植，且實(shí)驗結(jié)果正確、可靠。 目前，MSC對免疫系統(tǒng)影響及其機(jī)制還并不十分清楚，它們潛在的臨床應(yīng)用價值，包括誘導(dǎo)異基因移植物耐受和免疫調(diào)節(jié)作用，還有待于進(jìn)一步的研究。 目的 本實(shí)驗室前期已成功構(gòu)建了永生化BMI。MSCs細(xì)胞株，同時發(fā)現(xiàn)BMI-MSCs具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用，而豬MSC在人體內(nèi)微環(huán)境中，將進(jìn)一步發(fā)生分化。本課題主要目的是通過做

7、細(xì)胞生長曲線和RT-PCR、單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等方法研究家豬MSC的最佳培養(yǎng)方案及在體外誘導(dǎo)分化后是否還能維持其低免疫原性，仍具有免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步探討豬MSC的臨床應(yīng)用可行性。 方法 原代培養(yǎng)MSC細(xì)胞從版納微型豬近交系(Banna minipig inbred-line，BMI)骨髓中分離獲得，永生化BMI-MSCs由本室劉瑾等構(gòu)建。選擇第3代原代培養(yǎng)BMI-MSCs細(xì)胞和第14代永生化BMI-MSCs兩株細(xì)

8、胞，接種于96孔板中，設(shè)置37℃、38℃、39℃、40℃四個不同的培養(yǎng)溫度，每天MTT法測定OD值，測定7天。繪制細(xì)胞生長曲線從而判定最佳體外該細(xì)胞培養(yǎng)溫度。選用胎牛血清、豬血清、新生牛血清三種不同的血清，做生長曲線，篩定最佳培養(yǎng)血清種類。再用β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸磷酸鹽等體外誘導(dǎo)其分化為成骨細(xì)胞，茜素紅法染色礦化結(jié)節(jié)鑒定成骨分化的成功。以BMI外周血淋巴細(xì)胞(peripheral bloodlymphocyte，PBLs)

9、為陽性對照，用RT-PCR法和流式細(xì)胞術(shù)法、免疫熒光法檢測分化MSC的主要組織相容性抗原(swine lymphocyte antigenclass Ⅰ，class Ⅱ，SLA Ⅰ，SLA Ⅱ)的表達(dá)情況，用單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)的方法檢測分化MSC是否仍不能引起人外周血淋巴細(xì)胞(human peripheral blood lymphocyte，hPBL)的增殖反應(yīng)，同時用植

10、物凝集素(phytohaemaglutinin，PHA)刺激hPBL增殖，檢測分化MSC對hPBL的增殖是否仍具有抑制作用。 結(jié)果 1)原代BMI-MSCs體外培養(yǎng)所用血清經(jīng)實(shí)驗證明，10％胎牛血清優(yōu)于10％豬血清，更優(yōu)于10％小牛血清。10％胎牛血清和10％豬血清均適宜原代BMI-MSCs的生長，而10％小牛血清不能滿足原代BMI-MSCs的正常生長。 2)永生化BMI-MSCs體外培養(yǎng)所用血清經(jīng)實(shí)驗證明，10

11、％胎牛血清優(yōu)于10％豬血清，更優(yōu)于10％小牛血清。三種血清均能滿足永生化BMI-MSCs的正常生長。 3)原代和永生化BMI-MSCs不同溫度條件下體外培養(yǎng)實(shí)驗證明，37℃、38℃、39℃、40℃四個溫度兩種細(xì)胞均可正常生長，四者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 4)RT-PCR法檢測未分化和分化BMI-MSCs上SLA Ⅰ、Ⅱ表達(dá)情況表明，未分化和分化BMI-MSCs上均有SLA Ⅰ表達(dá)，未分化BMI-MSCs上無SLAⅡ表達(dá)，分

12、化BMI-MSCs上有SLAⅡ表達(dá)。 5)免疫熒光法檢測未分化和分化BMI-MSCs上SLA Ⅱ(SLA-DR)表達(dá)情況同樣表明，未分化BMI-MSCs上無SLAⅡ表達(dá)，分化BMI-MSCs上有SLAⅡ表達(dá)。 6)流式細(xì)胞術(shù)法檢測未分化和分化BMI-MSCs上SLAⅡ(SLA-DR)表達(dá)情況也表明，未分化BMI-MSCs上無SLA Ⅱ表達(dá)，分化BMI-MSCs上有SLAⅡ表達(dá)。 7)經(jīng)絲裂霉素C處理的未分化和分化

13、BMI-MSCs與hPBLs的單向MLR結(jié)果表明，未分化和分化BMI．MSCs均不能刺激hPBLs增殖，具有低免疫原性。 8)經(jīng)絲裂霉素C處理的未分化和分化BMI-MSCs加入到經(jīng)PHA刺激的hPBLs中的單向MLR結(jié)果表明，未分化和分化BMI-MSCs均能抑制PHA引起的hPBLs的增殖。 結(jié)論 體外培養(yǎng)BMI-MSCs時，胎牛血清優(yōu)于豬血清，更優(yōu)于小牛血清。小牛血清幾乎不能使原代BMI-MSCs細(xì)胞增殖，胎牛

14、血清和豬血清均適宜該細(xì)胞的生長，胎牛血清優(yōu)于豬血清。三種血清均適宜永生化BMI-MSCs細(xì)胞的生長，豬血清比小牛血清好，胎牛血清比豬血清更好。但溫度組不同的BMI-MSCs細(xì)胞，其生長速度無顯著性差異，在37℃、38℃、39℃、40℃四個溫度原代和永生化BMI-MSCs細(xì)胞均可正常生長。 RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光結(jié)果顯示未分化MSC只有SLA I表達(dá)；分化MSC既有SLAI，也有SLAⅡ的表達(dá)。但單向MLR結(jié)果顯示分化