SATB2基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)鈦種植體的骨結(jié)合.pdf

1、種植體在臨床的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，除了修復(fù)和替代缺失牙齒外，在上下頜骨的整形修復(fù)中也被大量使用，種植體治療已經(jīng)成為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和常規(guī)的程序。
　　 種植體成功的一個(gè)重要標(biāo)志就是形成骨結(jié)合，骨結(jié)合是在光學(xué)顯微鏡水平觀察到的種植體和宿主骨的直接接觸形式，此狀態(tài)下種植體可以承受壓力并行使功能。骨結(jié)合一個(gè)重要的前提條件就是種植體周?chē)鹿堑纳?。但是在種植體植入后，種植體周?chē)窃偕鄬?duì)比較慢。而且在初始愈合期以后，由于種植體周?chē)滦纬晒堑墓敲芏缺?/p>

2、較低，種植體周?chē)墓墙M織對(duì)種植體的支持有限，因此對(duì)種植體骨結(jié)合的研究依然面臨很大的挑戰(zhàn)。很多的基礎(chǔ)和臨床研究致力于如何通過(guò)縮短種植體骨結(jié)合的時(shí)間來(lái)縮短治療周期，提高治療的效率。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，最常見(jiàn)的方法就是通過(guò)改變種植體的設(shè)計(jì)參數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些改變包括種植體的材料，種植體外形的修改以及種植體表面的修飾。目前認(rèn)為，種植體的骨結(jié)合是通過(guò)成骨細(xì)胞的活動(dòng)來(lái)完成的，大部分對(duì)種植體表面的修飾都是為了促進(jìn)或者改善種植體周?chē)M織中細(xì)胞對(duì)種植體的反應(yīng)。

3、除了通過(guò)對(duì)種植體表面的修改來(lái)促進(jìn)種植體的骨結(jié)合，也有一些通過(guò)系統(tǒng)或者局部應(yīng)用與成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或者生長(zhǎng)因子增加骨-種植體的結(jié)合。Satb2是近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在成骨細(xì)胞的分化以及牙和顱頜面發(fā)育中起重要重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。Satb2可以與成骨分化相關(guān)的重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx以及Atf4等協(xié)同作用，提高其在骨骼發(fā)育及成骨細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用，并可以直接結(jié)合于成骨細(xì)胞特異性基因BSP和OCN的啟動(dòng)子促進(jìn)BSP和OCN的表達(dá)，另外，S

4、atb2可以下調(diào)成骨細(xì)胞中抑制骨形成的Hoxa2的表達(dá)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成骨。Satb2基因敲除鼠的胚胎顯示多發(fā)的顱頜面缺陷，包括下頜骨明顯的短小，鼻骨和上頜骨的發(fā)育不足，舌骨的畸形以及腭裂，且基因敲除小鼠一般在出生后立即死亡，在對(duì)Satb2基因敲除鼠的成骨細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)：其成骨細(xì)胞的分化和功能存在缺陷，骨的形成和鈣化延遲，基質(zhì)中膠原的表達(dá)顯著降低，在細(xì)胞外基質(zhì)的沉積中存在明顯的缺陷。研究者認(rèn)為，Satb2在成骨細(xì)胞的分化以及顱頜

5、面的發(fā)育中是一個(gè)重要的骨發(fā)育性調(diào)節(jié)分子，是骨骼發(fā)育以及成骨細(xì)胞分化的基因調(diào)控系統(tǒng)中的分子樞紐。因此有理由相信，Satb2在骨形成及骨重建中起到重要的調(diào)節(jié)作用，是未來(lái)骨修復(fù)和骨組織工程中理想的候選因子。
　　 因此本實(shí)驗(yàn)納入Satb2作為研究對(duì)象，采用RCAS或pBABE-Hygro兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)，以基因轉(zhuǎn)染的方法將Satb2過(guò)表達(dá)于植入BSP-TVA轉(zhuǎn)基因小鼠中的種植體周?chē)^察Satb2局部高表達(dá)在種植體周?chē)晒羌肮?/p>

6、結(jié)合中的作用。這兩種不同的病毒表達(dá)載體感染BSP-TVA轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞不同。其中RCAS逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)可以使編碼Satb2的病毒RCAS-Satb2特異性感染種植體周?chē)M織中BSP陽(yáng)性的細(xì)胞，而pBABE-Hygro-Satb2逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)可以感染種植體周?chē)蟹至哑诩?xì)胞。通過(guò)檢測(cè)兩組結(jié)果的異同，可進(jìn)一步了解不同細(xì)胞參與種植體周?chē)M織的成骨是否存在差異。同時(shí)，采用局部使用高表達(dá)Satb2骨髓基質(zhì)細(xì)胞的辦法，檢測(cè)局部使用Sat

7、b2基因轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在種植體骨結(jié)合中的作用。從而探討Satb2基因治療促進(jìn)種植體骨結(jié)合的效果及基因轉(zhuǎn)染方式。
　　 材料和方法：
　　 第一部分：本實(shí)驗(yàn)納入了研究成骨的理想的動(dòng)物模型：BSP-TVA轉(zhuǎn)基因小鼠。該轉(zhuǎn)基因小鼠利用獨(dú)特的RCAS-TVA系統(tǒng)，通過(guò)4.9kb的BSP啟動(dòng)子控制TVA基因的表達(dá)，使TVA基因選擇性表達(dá)在成骨細(xì)胞中，表達(dá)TVA的分裂期哺乳細(xì)胞可以很容易被RCAS感染。成功構(gòu)建RCAS-Satb

8、2逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體。在種植體植入BSP-TVA小鼠的股骨的遠(yuǎn)心端前，將含有108 cfu/ml的編碼Satb2或者RCAS空載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒3μl注入種植體窩。術(shù)后1周及3周取材，通過(guò)H&E染色觀察種植體周?chē)M織的成骨情況，采用H&E染色、BSP免疫組化染色和組織學(xué)測(cè)量評(píng)價(jià)Satb2高表達(dá)在種植體的愈合及骨結(jié)合中的作用。同時(shí)對(duì)術(shù)后1周及3周種植體上下1mm范圍的骨組織提取RNA后，通過(guò)Real-time RT-PCR檢測(cè)組織中Satb2及

9、成骨相關(guān)基因Osx、Runx2、BSP、COLI及OC的表達(dá)情況，觀察Satb2在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組組織中的變化。
　　 第二部分：實(shí)驗(yàn)采用了另外一個(gè)不同的病毒表達(dá)系統(tǒng)，pBABE-Hygro逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體系統(tǒng)。在成功包裝pBABE-Hygro-Satb2及pBABE-Hygro病毒并將病毒滴度調(diào)整到108cfu/ml后，我們采用與第一部分相同的手術(shù)方法及檢測(cè)方法對(duì)pBABE-Hygro-Satb2促進(jìn)種植體骨結(jié)合的作用進(jìn)行了檢

10、測(cè)。
　　 第三部分：應(yīng)用pBABE-Hygro-Satb2及pBABE-Hygro逆轉(zhuǎn)錄病毒體外感染EGFP標(biāo)記的BMSCs，檢測(cè)感染后2天，9天及23天的BMSCs中Satb2及成骨相關(guān)基因Osx、Runx2、BSP、COLI及OC的表達(dá)。將感染后48小時(shí)的BMSCs細(xì)胞懸液局部應(yīng)用于B6D2F1小鼠股骨的種植體部位，采用與第一部分相同的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)超表達(dá)Satb2的BMSCs在種植體的骨結(jié)合中的作用進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)用GFP免疫

11、組化染色的方法追蹤外源性的BMSCs在組織中的去向及功能。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：局部使用RCAS及RCAS-Satb2病毒，術(shù)后1周，H&E染色結(jié)果顯示：種植體周?chē)行滦纬傻木幙椆?；與種植體直接接觸的宿主組織中，活化的成骨樣細(xì)胞排列規(guī)律，呈復(fù)層圍繞種植體；周?chē)M織中還有一些炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組中種植體周?chē)墓敲娣e百分比(％bone area)高于對(duì)照組，但差異無(wú)顯著性。實(shí)驗(yàn)組中，與種植體直接接觸的宿主組織已有

12、30％左右與種植體形成骨結(jié)合，可見(jiàn)處于活躍期的成骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組中宿主與種植體發(fā)生骨結(jié)合的區(qū)域是對(duì)照組2倍。采用Real-timeRT-PCR技術(shù)對(duì)種植體周?chē)?mm范圍內(nèi)成骨相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組中Satb2的表達(dá)增加約3倍，Osx，Runx2，BSP，COLI和OC的表達(dá)也顯著增加。而B(niǎo)SP免疫組化結(jié)果與實(shí)時(shí)定量檢測(cè)BSP的結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)組中BSP的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和間質(zhì)中BSP的信號(hào)都高于對(duì)照組。
　　 術(shù)后3周，種植體被大

13、量的骨組織包繞，與種植體直接接觸的部位，有編織骨及板層骨，周?chē)慕M織中已經(jīng)沒(méi)有明顯的炎癥。H&E染色組織測(cè)量結(jié)果顯示：3周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中種植體周?chē)墓敲娣e百分比高于對(duì)照組，宿主組織與種植體之間的結(jié)合主要為骨結(jié)合，實(shí)驗(yàn)組中與種植體直接接觸的宿主組織已有80％左右與種植體形成骨結(jié)合，實(shí)驗(yàn)組中骨結(jié)合區(qū)域的比例是對(duì)照組的1.4倍。同時(shí)檢測(cè)了3周時(shí)，種植體周?chē)?mm范圍內(nèi)Satb2及成骨相關(guān)基因的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組中Satb2，Osx，Runx2，BSP

14、，COLI和OC的表達(dá)均略高于對(duì)照組，但差異均無(wú)顯著性。而B(niǎo)SP免疫組化的計(jì)數(shù)結(jié)果在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組也無(wú)顯著差異。
　　 第二部分：局部使用pBABE-Hygro及pBABE-Hygro-Satb2逆轉(zhuǎn)錄病毒，術(shù)后1周，H&E染色結(jié)果顯示：種植體周?chē)霈F(xiàn)新形成的編織骨，與種植體直接接觸的部位，活化的成骨樣細(xì)胞排列規(guī)律整齊，呈復(fù)層圍繞種植體，周?chē)慕M織中可見(jiàn)少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組中種植體周?chē)墓敲娣e百分比高于對(duì)照組。與種植體直接

15、接觸的宿主組織已有10％左右與種植體形成骨結(jié)合，實(shí)驗(yàn)組中宿主與種植體發(fā)生骨結(jié)合的區(qū)域大于對(duì)照組，但差異無(wú)顯著性。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示：術(shù)后1周，實(shí)驗(yàn)組中Satb2的表達(dá)增加約2倍，成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Osx和Runx2，及成骨特異性基因BSP及COLI表達(dá)顯著增加；而OC的表達(dá)雖然有增加，但與對(duì)照組相比差異沒(méi)有顯著性。實(shí)驗(yàn)組BSP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組。
　　 術(shù)后3周，H&E染色結(jié)果顯示，種植體主要被骨組織包繞

16、，與種植體直接接觸的部位，主要為不同形態(tài)的骨組織，實(shí)驗(yàn)組中種植體周?chē)墓墙M織是排列規(guī)則的板層骨及少量的編織骨，與種植體直接接觸的區(qū)域也是礦化良好的骨組織；對(duì)照組中，與種植體直接接觸的骨組織中，局部有未完全礦化的細(xì)胞成分存在。3周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中種植體周?chē)敲娣e百分比高于對(duì)照組，宿主組織與種植體之間的結(jié)合主要為骨結(jié)合，實(shí)驗(yàn)組中宿主與種植體發(fā)生骨結(jié)合的區(qū)域是對(duì)照組的約1.6倍。種植體植入3周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中Satb2的表達(dá)仍顯著高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中

17、成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Osx，Runx2及與成骨密切相關(guān)的BSP，COLI，OC的基因表達(dá)均明顯增加，與對(duì)照組相比差異具有顯著性。實(shí)驗(yàn)組中BSP的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組。
　　 第三部分：1周時(shí)，GFP陽(yáng)性的BMSCs分散位于種植體周?chē)慕M織中，分布不均勻；3周時(shí)，在種植體周?chē)匀豢梢詸z測(cè)到GFP陽(yáng)性的BMSCs存在；Satb2過(guò)表達(dá)的BMSCs在3周時(shí)促進(jìn)了種植體的骨結(jié)合，并促進(jìn)了種植體周?chē)鹿堑男纬?。體內(nèi)外Real-time RT

18、-PCR結(jié)果基本一致，在3周時(shí)，種植體周?chē)M織中Satb2及成骨相關(guān)基因的表達(dá)仍然高于對(duì)照組，與第二部分3周時(shí)的結(jié)果相一致。
　　 結(jié)論：
　　 1.局部使用RCAS或pBABE-Hygro兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)，均可以以基因轉(zhuǎn)染的方法將Satb2轉(zhuǎn)入BSP-TVA轉(zhuǎn)基因小鼠股骨種植體周?chē)M織中，并在種植體的局部高表達(dá)Satb2。
　　 2.Satb2在種植體局部的高表達(dá)能夠促進(jìn)種植體部位組織中成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄

19、因子Osx和Runx2的表達(dá)，同時(shí)提高了成骨特異性基因BSP，COLI及OC的表達(dá)；使用RCAS-Satb2逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)，能夠顯著提高種植體1周時(shí)的骨結(jié)合；3周時(shí)，Satb2促進(jìn)了種植體的骨結(jié)合并促進(jìn)了種植體周?chē)鹿堑男纬伞?br>　　 3.通過(guò)RCAS及pBABE-Hygro兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)將Satb2應(yīng)用于種植體的局部在種植體周?chē)M織的成骨機(jī)制中存在明顯的差異。兩組在種植體周?chē)M織中成骨機(jī)制的差異，可能與RCAS逆轉(zhuǎn)錄