靶向干擾PRMT2基因?qū)Υ萍に亟閷?dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　利用microRNA(miRNA)靶向干擾人蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2（protein arginine methyltransferase2, PRMT2）基因表達(dá)，鑒定其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF7后對細(xì)胞增殖的影響。
　　方法：
　　以脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000為載體，將針對特異靶點(diǎn)PRMT2基因的miRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞MCF7中。采用間接免疫熒光法和western blot

2、法檢測重組體對 PRMT2的干擾效果以確定其生物活性。采用結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)檢測重組體轉(zhuǎn)染對MCF7細(xì)胞體外增殖的影響，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測MCF7細(xì)胞克隆形成能力的影響。流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry, FCM）檢測重組體轉(zhuǎn)染對MCF7細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果：
　　1．構(gòu)建的重組體插入片段的堿基序列完全正確，間接免疫熒光法和 western blotting法檢測表明：重組體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞后可成功干擾PRMT

3、2基因的表達(dá)。
　　2．結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)表明：在無雌激素作用時(shí)，重組體轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的生長速度無明顯影響；與轉(zhuǎn)染空載體的MCF7細(xì)胞相比，在10 nmol/L E2作用下，轉(zhuǎn)染重組體的MCF7細(xì)胞的增殖速度明顯增加（P＜0.05），在100 nmol/L雌激素受體拮抗劑4OHT作用下，重組體組對MCF7細(xì)胞的增殖無明顯影響。
　　3．Western blotting法檢測表明：重組體能夠增加雌激素介導(dǎo)的ERα目標(biāo)基因CyclinD1和

4、c-Myc的表達(dá)。
　　4．平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，重組體能夠促進(jìn)雌激素介導(dǎo)的MCF7細(xì)胞的克隆形成。
　　5．FCM法檢測表明，轉(zhuǎn)染重組體的MCF7細(xì)胞中G2期細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．成功構(gòu)建靶向PRMT2基因的microRNA真核表達(dá)載體，并成功構(gòu)建了穩(wěn)定低表達(dá)PRMT2的MCF7細(xì)胞系。
　　2．抑制 PRMT2的表達(dá)能夠提高雌激素介導(dǎo)的MCF7細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。