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文檔簡介
1、目的:
利用microRNA(miRNA)靶向干擾人蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2(protein arginine methyltransferase2, PRMT2)基因表達(dá),鑒定其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF7后對細(xì)胞增殖的影響。
方法:
以脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000為載體,將針對特異靶點(diǎn)PRMT2基因的miRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞MCF7中。采用間接免疫熒光法和western blot
2、法檢測重組體對 PRMT2的干擾效果以確定其生物活性。采用結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)檢測重組體轉(zhuǎn)染對MCF7細(xì)胞體外增殖的影響,平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測MCF7細(xì)胞克隆形成能力的影響。流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測重組體轉(zhuǎn)染對MCF7細(xì)胞周期的影響。
結(jié)果:
1.構(gòu)建的重組體插入片段的堿基序列完全正確,間接免疫熒光法和 western blotting法檢測表明:重組體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞后可成功干擾PRMT
3、2基因的表達(dá)。
2.結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)表明:在無雌激素作用時(shí),重組體轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的生長速度無明顯影響;與轉(zhuǎn)染空載體的MCF7細(xì)胞相比,在10 nmol/L E2作用下,轉(zhuǎn)染重組體的MCF7細(xì)胞的增殖速度明顯增加(P<0.05),在100 nmol/L雌激素受體拮抗劑4OHT作用下,重組體組對MCF7細(xì)胞的增殖無明顯影響。
3.Western blotting法檢測表明:重組體能夠增加雌激素介導(dǎo)的ERα目標(biāo)基因CyclinD1和
4、c-Myc的表達(dá)。
4.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,重組體能夠促進(jìn)雌激素介導(dǎo)的MCF7細(xì)胞的克隆形成。
5.FCM法檢測表明,轉(zhuǎn)染重組體的MCF7細(xì)胞中G2期細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)。
結(jié)論:
1.成功構(gòu)建靶向PRMT2基因的microRNA真核表達(dá)載體,并成功構(gòu)建了穩(wěn)定低表達(dá)PRMT2的MCF7細(xì)胞系。
2.抑制 PRMT2的表達(dá)能夠提高雌激素介導(dǎo)的MCF7細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。
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