MDC1調(diào)控雌激素受體ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄并抑制乳腺癌增殖與侵襲.pdf

1、目的:
　　乳腺癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈較快增長趨勢，且發(fā)病年齡趨向年輕化[1]。盡管臨床研究已經(jīng)取得了較大的進步，但是其復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率仍然很高。然而，乳腺癌的病因和發(fā)生發(fā)展的分子機制尚未完全清楚，弄清病因和發(fā)生發(fā)展的分子機制是目前迫切需要解決的問題，對其進行更加廣泛和深入的研究有助于提高乳腺癌的診斷和治療的成功率。
　　雌激素受體ERα是核受體超家族成員之一，是一種配體依賴性活化的轉(zhuǎn)錄因子[6]。研

2、究證實正常乳腺上皮細胞內(nèi)ERα很少高表達，而在大約60％-80％的乳腺癌中ERα呈現(xiàn)高表達，而且ERα相關(guān)信號通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用[2-3]。許多ERα輔轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子被鑒定參與乳腺癌的進展。MDC1（也稱為NFBD1）在DNA發(fā)生損傷時可通過募集DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)DNA損傷后修復(fù)。MDC1基因缺陷小鼠會引起細胞染色體穩(wěn)定性降低，免疫缺陷，DNA修復(fù)缺陷等現(xiàn)象[30]。我們前期的研究表明MDC1參與調(diào)控雄

3、激素受體AR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄并在前列腺癌中發(fā)揮抑癌作用，據(jù)此我們推測MDC1很可能與結(jié)構(gòu)相似并同屬于核受體家族的ERα相互作用，進而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。
　　在本研究中，我們的目標(biāo)是明確MDC1是否參與調(diào)節(jié)雌激素受體ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄以及MDC1是否影響乳腺癌的增殖和/或遷移，并試圖探索相關(guān)分子機制，為乳腺癌治療方法提供新的治療靶點及新思路。
　　方法:
　　一、MDC1在正常乳腺組織及乳腺癌組織中的表達方式

4、　　1、Western Blot實驗檢測MDC1在乳腺癌癌旁組織及乳腺癌組織中表達水平。
　　二、ERα與MDC1在體內(nèi)外相互作用的驗證
　　1、應(yīng)用免疫共沉淀（Co-IP）實驗確定ERα與MDC1在細胞內(nèi)的相互作用。
　　2、應(yīng)用共焦激光掃描顯微鏡觀察ERα與MDC1的定位及共定位。
　　三、MDC1調(diào)節(jié)ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄
　　1、應(yīng)用雙報告基因檢測系統(tǒng)(Dual-Luciferase Assay Sy

5、stem)檢測MDC1對ERα介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。
　　2、干擾MDC1表達檢測MDC1對乳腺癌細胞內(nèi)的內(nèi)源ERα靶基因mRNA表達的影響。
　　四、MDC1調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖和遷移
　　1、構(gòu)建MDC1穩(wěn)定敲低乳腺癌細胞系。
　　2、應(yīng)用細胞克隆形成實驗檢測MDC1對乳腺癌細胞增殖的影響。
　　3、應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測MDC1對乳腺癌細胞周期的影響。
　　4、荷瘤小鼠檢測MDC1是否在體內(nèi)影響乳腺癌

6、細胞成瘤及腫瘤生長。
　　5、Transwell實驗檢測MDC1對乳腺癌細胞遷移的影響。
　　結(jié)果:
　　一、MDC1在乳腺癌組織中的表達情況
　　1、Western Blot實驗證實MDC1在乳腺癌組織表達量低于癌旁正常組織
　　二、ERα與MDC1在體內(nèi)外相互作用的驗證
　　1、ERα與MDC1在細胞內(nèi)的相互作用。
　　2、在E2存在情況下ERα與MDC1存在共定位。
　　三、MDC1

7、調(diào)節(jié)ERα介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄
　　1、在E2存在的情況下MDC1上調(diào)ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄
　　2.干擾MDC1表達下調(diào)乳腺癌細胞內(nèi)的內(nèi)源ERα靶基因mRNA表達水平。
　　四、MDC1調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖和遷移
　　1、成功構(gòu)建MDC1穩(wěn)定敲低乳腺癌細胞系。
　　2、細胞克隆形成實驗證實敲低MDC1促進乳腺癌細胞增殖。
　　3、流式細胞術(shù)證實敲低MDC1明顯增強乳腺癌S期及G2/M期細胞。
　　4、荷