基于噬菌體展示技術的副豬嗜血桿菌的抗體文庫構建.pdf

1、副豬嗜血桿菌是定居于豬的上呼吸道中機會性病原菌,在特定的條件下引發(fā)疾病。感染豬引起的疾病,稱副豬嗜血桿菌病,也稱為豬的革拉瑟氏病,以多發(fā)性漿液纖維性漿膜炎、關節(jié)炎、腦膜炎和心包炎為病理特征。近年來大規(guī)模爆發(fā)該病給各國各地區(qū)的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失,而國內外防制該病多采用傳統(tǒng)的全菌體疫苗和使用多品種大劑量抗生素。雖然在防制豬的革拉瑟氏病取得了一定的成效,但是,常常導致防制的失敗。因此,本研究擬采用近年來出現(xiàn)的噬菌體抗體展示技術,建立副

2、豬嗜血桿菌抗體的噬菌體展示文庫,試圖篩選針對性強的適用的預防及治療性抗體制劑,為制備針對副豬嗜血桿菌病的抗體開辟新途徑。
　　 本研究的主要結果如下:
　　 1.提取經(jīng)副豬嗜血桿菌滅活疫苗免疫后屠宰豬脾臟組織中總RNA,經(jīng)Oligo(dT)15反轉錄后,用豬的IgG可變區(qū)輕重鏈特異性引物擴增可變區(qū)基因。擴增到12條可變區(qū)基因,包括H鏈基因的5條序列,k鏈基因的5條序列和入鏈基因的2條序列。
　　 2.將12條序列

3、分別克隆到測序載體pMD19-T上進行測序,測序結果與NCBI中豬的IgG的可變區(qū)序列比對,均屬于豬的IgG的可變區(qū)序列。通過IMGT數(shù)據(jù)庫中VQuest軟件比對分析可變區(qū)推導氨基酸的殘基,劃分為7區(qū),分別為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。所有序列的CDR是可變的,尤其是CDR3。
　　 3.采用帶有l(wèi)inker接頭片段的引物,利用重疊延伸PCR組合了VH鏈和VL鏈的基因,組裝成6條scFv。

4、>　　 4.將6條scFv分別克隆到噬菌粒pC3C,用氯化鈣法轉化到大腸桿菌XL1-Blue,構建了重組子pC3C-scFv。經(jīng)酶切鑒定,結果與預期結果一致,測序鑒定pC3C-scFv陽性重組子,與預期結果99％以上相同。以輔助噬菌體VCSM13救援陽性重組子,建立了噬菌體抗體庫。
　　 5.用IPTG誘導重組子pC3C-H2.2k1.1表達scFv,其表達產(chǎn)物的分子量大小約為30kDa。
　　 6.對重組子pC3C-