展青霉素抗體的制備及其核糖體展示單鏈抗體文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、展青霉素（patulin，PAT）是由青霉屬和曲霉屬等真菌所產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物，廣泛地存在于水果及其制品中。1943年發(fā)現(xiàn)之初曾因其具有一定的抑菌作用而被用作臨床試驗(yàn)，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其具有腎毒性，遺傳毒性及致畸性等作用，危害公共衛(wèi)生。因此建立快捷準(zhǔn)確的免疫學(xué)檢測(cè)方法非常必要，而制備抗展青霉素的特異性抗體是其中極為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。本研究利用化學(xué)偶聯(lián)的方法成功制備了人工完全抗原PAT-HG-OVA和PAT-HS-BSA;按照嚴(yán)格的動(dòng)物免疫

2、程序獲得了抗展青霉素多克隆抗體;根據(jù)基因工程原理構(gòu)建了大容量、免疫后鼠源核糖體展示（Ribosome display，RD）單鏈抗體(Single-Chain Fragment Variant,scFv)文庫(kù)。研究成果為展青霉素免疫學(xué)檢測(cè)方法的進(jìn)一步發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
　　1.展青霉素完全抗原的合成與鑒定
　　展青霉素屬于小分子半抗原，不具有免疫原性，因此需要將其偶聯(lián)到載體蛋白上構(gòu)建成完全抗原之后方可用來免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)先

3、用4-二甲氨基吡啶(DMAP)作為催化劑使展青霉素分別與戊二酐酸(HG)和丁二酐酸(HS)反應(yīng)，生成展青霉素-戊二酐酸(PAT-HG)和展青霉素-丁二酐酸(PAT-HS)。合成結(jié)果經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)(HPLC-MS)鑒定成功。修飾之后的展青霉素使用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀亞胺(NHS)作為偶聯(lián)劑，分別選用牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清白蛋白(OVA)為蛋白載體，制備了PAT-HS-BSA和PA

4、T-HG-OVA人工合成完全抗原，并使用紫外光譜分析和SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果顯示人工完全抗原偶聯(lián)成功，可用于動(dòng)物免疫制備相應(yīng)抗體。
　　2.展青霉素抗體的制備及鑒定
　　為獲得抗展青霉素特異性抗體，本研究使用所制備的人工完全抗原PAT-HS-BSA對(duì)Balb/C小鼠進(jìn)行免疫，以弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑為免疫佐劑，采用背部皮下多點(diǎn)注射的方式，共免疫五次。五免后小鼠抗體效價(jià)穩(wěn)定在1∶1600，成功制備得到抗展青霉

5、素多克隆抗體。之后嘗試制備展青霉素單克隆抗體，取沖擊免疫后的小鼠，分離得到其脾細(xì)胞，并與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按照傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)方法進(jìn)行融合，運(yùn)用間接ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行篩選，共計(jì)細(xì)胞融合和篩選兩次，未篩選出陽性細(xì)胞株。
　　3.免疫后鼠源核糖體展示大容量單鏈抗體基因文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定
　　為構(gòu)建鼠源核糖體展示（ribosome display，RD）單鏈抗體(single chainvariable fragments，sc

6、Fv)文庫(kù)，本實(shí)驗(yàn)以展青霉素人工完全抗原免疫后的小鼠脾臟為實(shí)驗(yàn)材料。提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增鼠源抗體的VH、VL和Ck基因，采用重疊延伸PCR(SOE-PCR)技術(shù)，通過Linker((Gly4Ser)3)進(jìn)行拼接，構(gòu)建了單鏈抗體scFv基因文庫(kù)和核糖體展示基因文庫(kù);經(jīng)鑒定，所構(gòu)建的文庫(kù)中基因長(zhǎng)度約為1100 bp，庫(kù)容量約4.3×1013，文庫(kù)中的基因序列具有較好的多樣性和完整性。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了免疫后鼠源核