乳腺癌閱讀框架內(nèi)噬菌體文庫的構(gòu)建.pdf

1、目前，癌癥依然是當今世界的難題，全世界發(fā)病率最高的癌癥是肺癌，其次是乳腺癌，隨著生態(tài)環(huán)境的惡化和生活節(jié)奏的加快，癌癥在人群中的發(fā)病率逐年增高，每年大約新增100萬癌癥患者，而早期診斷和早期治療已經(jīng)被醫(yī)學(xué)界認為是解決癌癥最有效的療法。腫瘤標志物是反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)，通過腫瘤標志物相關(guān)參數(shù)的變化可以獲得大量的腫瘤生長信息，也為早期癌癥診斷提供了依據(jù)，
　　 噬菌體表面展示技術(shù)在癌癥腫瘤標志物的篩選中得到廣泛應(yīng)用，用pKE-

2、2質(zhì)粒經(jīng)卡那抗性篩選富集開放閱讀框架（open-reading frame ORF）內(nèi)陽性克隆，構(gòu)建閱讀框架內(nèi)乳腺癌噬菌體表面展示文庫可以提高篩選效率。方法：用Trizol試劑提取乳腺癌組織總RNA，分離純化mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。在雙鏈cDNA末端加上定向EcoRⅠ和HindⅢ接頭，用EcoRⅠ和HindⅢ消化接頭，使形成兩端分別帶有EcoRⅠ和HindⅡ粘性末端的雙鏈cDNA，將其連接于帶有EcoRⅠ和HindⅢ末端的p

3、KE-2質(zhì)粒載體，專化大腸桿菌DH5α，經(jīng)卡那抗性篩選，富集ORF克隆.回收ORF內(nèi)雙鏈cDNA片段，將其連接于帶有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的T7 Select10-3b載體，經(jīng)體外包裝后，以BLT5615為受體菌構(gòu)建T7噬菌體展示文庫。結(jié)果：經(jīng)過ORF篩選，文庫中ORF克隆比例達到80％，較篩選前的5％提高75％。經(jīng)測定，文庫滴度為2.85×105pfu/mL，重組率為99％，廣增后文庫滴度為2.65×109pfu/mL。對隨機