磺胺對甲氧嘧啶單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、磺胺類藥物有廣泛的抗菌特性,經(jīng)常用于防治動(dòng)物的疾病,這也導(dǎo)致了在可食用動(dòng)物組織中的殘留,最終對食品衛(wèi)生和人類健康造成危害.許多國家已經(jīng)規(guī)定磺胺藥在人類食用組織中的殘留限量為0.1mg/kg.國內(nèi)外已建立了很多理化方法檢測動(dòng)物性食品中殘留的磺胺藥.雖然有些方法比較靈敏精確,但由于花費(fèi)大、時(shí)間長、技術(shù)要求高等原因而不適合大批量樣品的篩選.作為一種快速、靈敏、特異的方法,酶聯(lián)免疫吸附測定正逐漸應(yīng)用于藥物的殘留檢測.該研究通過對抗原的合成和抗體

2、的制備,建立了SMD的ELISA測定方法,并檢測了實(shí)驗(yàn)條件下雞和豬體內(nèi)SMD的殘留變化.為了制備針對SMD的單克隆抗體,用戊二醛將SMD偶聯(lián)到牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA).用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行了掃描鑒定.該偶聯(lián)方法是通過SMD的N<'4>端偶聯(lián)到載體蛋白上,在這種情況下,特異的N<'1>端被免疫系統(tǒng)識別,這最終導(dǎo)致產(chǎn)生針對SMD的高特異性的抗體.將100μl含50μg SMD-BSA偶聯(lián)物的PBS與100μl的福氏完全佐劑

3、制成乳劑,用其注入7周齡的BALB/c小鼠的腹部皮下.每隔2-3w后,用100μl含25μg SMD-BSA偶聯(lián)物的PBS與100μl的福氏不完全佐劑制成乳劑進(jìn)行增強(qiáng)免疫.經(jīng)過3次增強(qiáng)免疫后,小鼠進(jìn)行最后一次抗原沖擊,3d后取其脾細(xì)胞.新鮮的脾細(xì)胞用來與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合.用間接ELISA和間接競爭ELISA來篩選陽性細(xì)胞.陽性孔的上清可與SMD-OVA反應(yīng),且這種反應(yīng)可被SMD競爭.用有限稀釋法將陽性孔細(xì)胞進(jìn)行克隆(重復(fù)三次).最終產(chǎn)

4、生了三株穩(wěn)定分泌針對SMD抗體的細(xì)胞:3E8、4A7、2D2.將3E8細(xì)胞注入5只BALB/c小鼠的腹腔,制備出腹水.建立起間接競爭ELISA的測定方法.以SMD濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線.用這種方法確定的檢測限為1.766ng/ml,定量限為11.274ng/ml.為檢驗(yàn)抗體的特異性,用SD、SMM、SQ等8種藥物作為競爭抗原,做ELISA,結(jié)果顯示與這8種磺胺藥沒有交叉反應(yīng).為了驗(yàn)證實(shí)際檢測效果,雞和豬在給予一定