戊糖乳桿菌C50-6細(xì)菌素的純化和特性研究.pdf

1、為了獲取廣譜、高效的乳酸菌細(xì)菌素產(chǎn)生菌，本文對(duì)分離自四川傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品(香腸、臘肉)中的91株乳酸菌，以大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)10209、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為指示菌

2、，采用打孔法初篩，進(jìn)一步通過(guò)排除有機(jī)酸、過(guò)氧化氫干擾及發(fā)酵液的蛋白酶降解實(shí)驗(yàn)復(fù)篩，得到1株產(chǎn)廣譜(能抑制G+菌和G-菌)細(xì)菌素的菌株C50-6，經(jīng)表型特征和16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育特征鑒定為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)。 采用單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)戊糖乳桿菌C50-6產(chǎn)細(xì)菌素的培養(yǎng)時(shí)間、溫度、起始pH條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：將菌株C50-6種子液按2％接種量接入起始pH6.0的MRS肉湯，經(jīng)30℃培養(yǎng)36h能獲

3、得較高的細(xì)菌素產(chǎn)量，其發(fā)酵液效價(jià)可達(dá)1151IU/ml，是原培養(yǎng)條件細(xì)菌素產(chǎn)量的3.6倍。 分別采用硫酸銨鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、正丙醇提取、pH吸附幾種方法對(duì)戊糖乳桿菌C50-6細(xì)菌素進(jìn)行粗分級(jí)分離，綜合分析后選取效果最好的硫酸銨鹽析法。該細(xì)菌素的純化步驟依次為：首先取發(fā)酵液離心得去菌體細(xì)胞的上清液，再向其中加入硫酸銨固體粉末至飽和度70％，靜置過(guò)夜，離心取沉淀溶于pH4.5的檸檬酸緩沖液得到細(xì)菌素粗提液，用相同的緩沖液進(jìn)行過(guò)夜透

4、析脫鹽，再經(jīng)過(guò)SP-Toyopeal-650M陽(yáng)離子交換色譜純化，采用含0.1mol/LNaCl的pH4.4的檸檬酸緩沖液洗脫可得細(xì)菌素的活性峰，最終細(xì)菌素比活提高了39倍，得率為21.8％。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)該細(xì)菌素的分子量約為2500Da，抑菌實(shí)驗(yàn)表明該蛋白條帶具有很強(qiáng)的抑菌活性，證實(shí)該電泳條帶即是細(xì)菌素。 對(duì)細(xì)菌素的發(fā)酵液和粗提液的特性進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液在pH2.0-5.0、粗提液在pH2.0-6

5、.0時(shí)顯示活性；發(fā)酵液100℃耐受20min，粗提液具有更高的熱穩(wěn)定性，121℃加熱20min后活性無(wú)損失；發(fā)酵液和粗提液都被木瓜蛋白酶和胰蛋白酶失活，被蛋白酶K部分失活，不被胃蛋白酶失活；發(fā)酵液和粗提液具有較一致的抑菌譜，二者均能有效抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等G+和G-細(xì)菌、能抑制戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)G21-10和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)C21-6等近源乳酸菌、